艾滋病是由HIV感染引起的严重威胁人类健康和社会稳定的传染病之一。为避免更多的人感染HIV,降低感染者的发病率,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。HIV-1 Tat (trans-activator of transcription)蛋白是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子,在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后,细胞质中合成的Tat可进入细胞核,与HIV-1新生RNA的反式激活效应元件(transactivating responsive region,TAR)结合促进其延长,反式激活HIV-1 RNA的转录,从而激活HIV-1的增殖。此外,Tat还可被感染细胞分泌到胞外发挥多种细胞外功能并在致病中起重要作用,其胞外活性主要包括:①抑制免疫细胞的增值、分化、诱导其凋亡;②激活静止的CD4+ T细胞,利于HIV感染和体内传播;③促进卡波式肉瘤肿瘤细胞的生长;④与HIV-1诱发的神经损伤有关,表现出神经毒性。碱性区也是Tat蛋白主要的中和表位之一。因此,阻断Tat分子对病毒复制的影响以及细胞外毒性作用,是研制预防性和治疗性Tat疫苗的主要依据。天然Tat作为免疫原所面临的一个重要的问题是结构松散,诱发的抗体特别是免疫保护性抗体滴度低,目前国内外无论是原核表达还是化学合成的Tat均不能诱导产生理想的免疫保护性抗体,因此,我们根据Tat的结构及每个结构域的功能特点对其进行改造,设计了多种新型免疫原,旨在提高其结构的稳定性、免疫原性以诱导出高滴度和持久的中和抗体。本研究分以下四部分进行:一、HIV-1型HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达为了分析新型Tat免疫原所诱导的抗体谱分布特点,我们对全长Tat及其各功能区(N端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-48aa)、碱性氨基酸富集区(49-57aa)、谷氨酰胺富集区(60-72aa)以及C端区(73-101aa))分段进行原核表达。具体为:PCR方法获得tat(1-101aa)、tat(1-48aa)、tat(22-72aa)、tat(38-101aa)、tat(49-101aa)和tat(60-101aa)片段,T/A克隆法将其克隆到pMD18-T载体进行测序。将验证正确的序列分别克隆到原核表达载体pPEPTIDE中构建其原核表达质粒:pPEPTIDE-tat(1-101aa)、pPEPTIDE-tat(1-48aa)、pPEPTIDE-tat(22-72aa)、pPEPTIDE-tat(38-101aa)、pPEPTIDE-tat(49-101aa)和pPEPTIDE-tat(60-101aa);将各表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达出相对分子量分别为34400、28800、29400、30700、29500、28000的Tat(1-101aa)、Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)、Tat(38-101 aa)、Tat(49-101aa)、Tat(60-101aa)、融合蛋白;Ni-NTA亲和层析法纯化出上述表达蛋白。ELISA检测显示Tat-PPEPTIDE和以上五个肽段均与兔抗Tat-PET32a抗血清呈特异性反应,其中Tat-PPEPTIDE反应最强,Tat(1-48aa)和Tat(22-72aa)的反应次之,整个C端肽段(Tat(38-101aa)、Tat(49-101aa)、Tat(60-101aa))的反应较弱,其中Tat(49-101aa)的反应高于Tat(38-101aa)和Tat(60-101aa)的反应。检测结果与国外报道的包括碱性区在内的第一外显子(1-72aa)是天然Tat重要的B细胞表位的结论相符,提示所表达的Tat-PPEPTIDE及其五个肽段能正确地反映天然Tat所诱导抗体的分布状况,可用于本研究的抗体表位谱分析。二、HIV-1型HXB2株Tat(B41-101N),Tat(B41-101C)两种融合蛋白的原核表达及免疫原性分析研究表明:Tat蛋白碱性区(49-57aa)介导Tat蛋白穿膜,与Tat细胞外活性密切相关,Tat的C端(73-101aa)包含重要的RGD模序,与Tat的“毒性”作用(如诱导细胞因子的产生)高度相关。我们分别将Tat的41-101aa置于天然Tat1-101aa的N端前构建Tat(B41-101N)新型免疫原和将Tat的41-101aa置换天然Tat1-101aa的N表位(1-21aa)构建Tat(B41-101C)新型免疫原,以期诱导出高滴度的针对碱性区和C末端区的中和抗体。根据大肠杆菌偏好密码子优化后的HIV-1型HXB2株Tat DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成HIV-1 tat(B41-101N)和tat(B41-101C)序列,T/A克隆法将其克隆到pMD18-T载体进行测序。将测序正确的tat(B41-101N)和tat(B41-101C)克隆至原核表达载体pET32a,构建其原核表达质粒pET32a-tat(B41-101N)和pET32a-tat(B41-101C)。将表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达出相对分子量分别为36000,34000的融合蛋白,并用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。用本实验室独立制备的小鼠特异性抗Tat单克隆抗体进行的Western-blot鉴定证实Tat(B41-101N)和Tat(B41-101C)与该单克隆抗体均呈特异性反应。用Tat(B41-101N)、Tat(B41-101C)、天然Tat分别免疫家兔,制备其抗血清,ELISA分析显示3种Tat免疫原均诱导出特异的Tat抗血清。其中针对全长Tat,Tat(B41-101C)诱导的抗血清滴度最高(1600000),天然Tat次之(800000),Tat(B41-101N)最低(200000)。表位分析结果显示:(1)针对Tat(1-48aa),仅天然Tat诱导出较高的抗血清,Tat(B41-101N)和Tat(B41-101C)均不能有效诱导出其抗血清,提示针对Tat(1-48)表位抗体的诱导依赖于天然Tat的构象;(2)三种免疫原诱导的抗血清与Tat(22-72aa)反应均较强,提示Tat(22-72aa)是Tat较稳定的表位;(3)Tat(B41-101C)诱导出相对于天然Tat明显增强的针对C端肽段Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa)的抗体,提示Tat(B41-101C)具有与天然Tat不同的免疫原性,这一特性有利于对Tat疫苗的改进;(4)Tat(B41-101C)与Tat(B41-101N)相比,提高了对Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa) C端区的反应性,提示N端序列可能对Tat诱导C末端抗体具有抑制作用。综上所述,我们成功构建并表达出Tat(B41-101N)和Tat(B41-101C)融合蛋白,新的免疫原显示出了与天然Tat不同的免疫原性,为进一步开发更为有效的新型Tat疫苗奠定基础。三、其它新型Tat免疫原产生的体液免疫应答分析为了进一步了解Tat免疫原特性,筛选最佳候选疫苗,除以上两种改造外,本课题组还设计了其它的Tat新型免疫原,分别为:①由于Cys-rich区易形成分子内或分子间二硫键影响Tat稳定性,我们将Cys-rich区22-37位氨基酸缺失构建了新的免疫原,命名为Tatqs;②由于Cys-rich的自佐剂作用,为了验证该作用是否受Cys-rich位置影响,我们分别将Cys-rich区置于N端前构建TatCN,将Cys-rich区置于C末端后构建TatCC;③为了进一步验证N端序列对Tat诱导C末端抗体具有抑制作用和提高C末端诱导产生的抗体滴度,我们构建了缺失N端序列的以第一外显子为主的Tat(22-72aa)和以C端表位为主的Tat(38-101aa)。将上述多种Tat新型免疫原与天然Tat分别免疫新西兰兔,制备其抗血清。对各免疫原所诱导的兔抗血清ELISA分析显示:(1)各免疫原均能诱导出针对全长Tat的特异抗体,但抗体滴度有较大的差别:Tat(B41-101C)所诱导抗血清滴度最高,Tat和Tat(22-72aa)次之,TatCN最低;(2)针对Tat(1-48aa)的反应,与第二部分结果类似,仅天然Tat诱导出较高的抗血清,而所有改造过的Tat免疫原均不能有效诱导出其抗血清,提示针对Tat(1-48)表位抗体的诱导依赖于天然Tat的构象;(3)与第二部分结果类似,所有免疫原所诱导的抗血清与Tat(22-72aa)反应均较强,提示Tat(22-72aa)是Tat较稳定的表位;(4)Tat(B41-101C)、Tat(38-101aa)和TatCC分别诱导出相对于天然Tat明显增强的针对C端肽段的抗体,其中Tat(B41-101C)和Tat(38-101aa)显著提高了针对C端Tat(49-101aa)和Tat(60-101aa)抗体的产生,TatCC显著提高了针对C端Tat(38-101aa)抗体的产生(均高于其他所有免疫原),进一步提示经改造的抗原可以产生与天然Tat不同的免疫原性,有利于对Tat疫苗的改进;(5)缺失N端的Tat(B41-101C)和Tat(38-101aa)诱导的针对C端的抗体均显著高于包含N端的Tat(B41-101N)和Tatqs,进一步支持N端序列对Tat诱导C末端抗体具有抑制作用的推测;(6)缺失Cys-rich区的Tatqs与天然Tat相比显著提高了蛋白的稳定性(形成的二聚体明显降低,结果未示),但无论是Tatqs(缺失Cys-rich区),还是TatCC和TatCN(改变Cys-rich的位置)诱导的抗血清均低于天然Tat,提示Cys-rich的自佐剂作用必须依赖于天然Tat构象。该部分结果进一步证明对Tat免疫原的改造可以改变其免疫原特性,诱导出高滴度的与天然Tat性质不同的抗体,为开发出更为有效的新型Tat疫苗奠定基础,同时对Tat分子的结构与功能的深入了解具有重要意义。四、不同Tat抗原检测HIV-1型感染者血清抗Tat抗体的比较用原核表达的天然Tat、7个改造后的Tat(Tat(B41-101N)、Tat(B41-101C)、Tat(B41-61N)、Tat(B41-61C)、TatCC、TatCN、Tatqs)和5个肽段(Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)、Tat(38-101aa)、Tat(49-101aa)、Tat(60-101aa))检测与HIV-1型感染者血清(12例天然Tat检测为抗Tat抗体阳性和10例抗Tat抗体阴性)的结合反应。ELISA结果显示(:1)HIV病人显示出不同Tat抗原反应模式:①与Tat(41-61C)为代表的多种抗原反应的血清比例最高,OD值最高;②以Tat(22-72aa)抗原反应为主的血清比例次高,OD值最低,大部分单独阳性,个别TatCN抗原也有反应;③以TatCN抗原反应为主的血清较少,OD值较高,多与其他抗原也有阳性反应。提示不同的病人血清对天然Tat产生出性质不同的抗体,这些不同的抗体反映模式与HIV感染进程、病情进展及预后是否存在某种相关性,以及对Tat免疫原的改造有何提示,值得进一步研究;(2)不同的抗原检测的OD值和阳性率存在较大的差别,其中多种抗原的检测效果明显优于天然Tat,这些抗原是否具有互补性,值得进一步研究,以提高Tat抗体的检测效果;(3)分别比较Tat(B41-101C)和Tat(B41-101N),Tat(B41-61C)和Tat(B41-61N)两组抗原与病人血清的反应性,结果显示缺失N端序列的Tat(B41-101C)和Tat(B41-61C)分别高于Tat(B41-101N)和Tat(B41-61N),提示N端序列对C端抗原与病人血清的反应可能具有抑制效应。综上,不同Tat抗原检测病人血清显示出一定的共性和特性,该研究为深入分析筛选最佳临床用检测抗原奠定基础。总结:1.本课题成功将Tat分成五个区段原核表达,五个肽段能正确地反映天然Tat所诱导抗体的分布状况,可用于本研究的抗体表位谱分析。2.我们成功构建并表达出7种Tat新型免疫原。新的免疫原显示出了与天然Tat不同的免疫原性,诱导出高滴度的与天然Tat性质不同的抗体,为开发出更为有效的新型Tat疫苗奠定基础,同时对Tat分子的结构与功能的深入了解具有重要意义。3.本课题用Tat五个肽段和多种改造后Tat蛋白检测HIV病人血清抗Tat抗体发现HIV病人可对Tat产生不同的抗体谱,对进一步深入分析Tat抗体模式与疾病发展的相关性和有效Tat疫苗的研发意义重大,同时也为研发出高特异性、灵敏度的Tat抗体检测试剂奠定基础。