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研究背景帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种老年神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)。PD以中脑黑质区多巴胺(Dopamine,DA)能神经元变性、缺失和路易小体形成为主要病理改变,出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓等特征性运动障碍和非运动性症状如:睡眠障碍、自主神经障碍等。其发病原因目前并不十分清楚,普遍认为与遗传、环境和年龄老化等因素有关。在PD研究中发现,其发病机制与线粒体密切相关,而Parkin是最常见的PD遗传易感基因之一,其突变或缺失可导致线粒体形态和功能改变,引发PD样症状,目前已成为研究PD发病机制的热点之一。PD治疗多以对症治疗为主,临床多采用左旋多巴及多巴胺受体激动剂的联合的治疗方案,虽然能在一定程度上缓解其症状,但长时间使用会出现药效减退,开关现象等副作用。中医临床治疗因其独特的理论体系和辨证论治的思想,取得了较为稳定的疗效。补阴牵正方(Bu-Yin-Qian-Zheng Formula,BYQZF)是由临床常用方剂大补阴丸(Da-Bu-Yin-Wan,DBYW)和牵正散(Qian-Zheng-San,QZS)组成的合方。本课题组在前期的实验研究中已明确了中药复方DBYW合QZS可以调控PD小鼠脑部线粒体酶复合物的活性及其基因表达,减轻线粒体DNA的损伤,在体外实验中证实其对MPP+介导的PD模型细胞线粒体功能具有明确的保护作用。在此研究的基础上,本实验以Parkin基因为切入点,通过现代分子生物学技术与传统中医理论相结合从细胞、分子水平,进一步探究BYQZF对PD细胞模型线粒体保护的作用环节和机制。研究目的本研究从Parkin基因角度,以线粒体为中心,揭示BYQZF对PD细胞模型中线粒体的保护作用,阐明BYQZF对PD中线粒体形态和功能的保护与Parkin基因调控的相关性,揭示BYQZF与Parkin蛋白及线粒体分裂和融合蛋白之间的联系,深入探寻BYQZF维持PD细胞模型中线粒体动态平衡的作用环节和分子机制。为中医临床应用提供进一步的实验依据,为中药的新药研究和开发奠定基础。研究方法实验一 Parkin基因敲减细胞模型的构建:采用RNAi技术构建Parkin敲减质粒并瞬时转染SH-SY5Y细胞,实验分3组:①正常对照组,不进行转染;②阴性对照组,转染阴性质粒;③Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒。荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞转染情况;流式细胞仪检测GFP表达率;RT-qPCR技术检测Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测Parkin蛋白的表达。实验二补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:实验分6组:①阴性质粒组,转染阴性质粒;②阴性质粒+MPP+组,转染阴性质粒后给予MPP+造模;③阴性质粒+MPP＋+中药组,转染阴性质粒后给予MPP+造模并进行中药干预;④Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒;⑤Parkin敲减＋MPP+组,转染Parkin敲减质粒后给予MPP+造模;⑥Parkin敲减＋MPP++中药组,转染Parkin敲减质粒后予MPP+造模并进行中药干预。CCK-8法检测各组细胞的存活率;MTR(MitoTracker(?)Red CMXRos,MTR)线粒体探针标记线粒体激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体的形态,利用软件分析线粒体形态因子、网络平均分支长度和数量及线粒体活性;荧光素酶法检测细胞中ATP水平;线粒体探针TMRM检测线粒体膜电位。实验三补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体动态平衡的影响:分组同实验二。Western Blot技术检测:控制线粒体质量的相关蛋白PINK1和Parkin的表达。免疫荧光双标技术及激光共聚焦扫描显微镜分别观察:①Parkin蛋白与PINK1蛋白在细胞的表达及共定位关系;②Parkin蛋白的亚细胞定位:与MTR线粒体探针共标记。Western Blot技术检测:①线粒体融合相关蛋白Mfn１、Mfn2及OPA1的表达;②线粒体分裂相关蛋白Fis１和Drp１的表达。研究结果实验一结果:1.转染情况的观察:阴性对照组及Parkin敲减组能够观察到较多的绿色荧光,绿色荧光蛋白表达率增加(转染质粒携带绿色荧光蛋白)。2.Parkin mRNA及蛋白表达的检测:Parkin敲减组细胞内的Parkin mRNA和蛋白的表达均显著降低,提示Parkin基因低表达细胞模型成功。实验二结果:1.细胞存活率的变化:转染阴性质粒的SH-SY5Y细胞用神经毒素MPP+处理后细胞存活率明显下降,中药BYQZF处理后其细胞存活率显著提高,而parkin敲减组细胞较阴性质粒组细胞存活率明显下降。parkin敲减细胞用MPP＋造模其细胞存活率也明显下降,再对其进行中药处理后并不能增加其细胞细胞存活率。2.线粒体形态的变化:MPP+处理转染阴性质粒的细胞线粒体形态因子、网络平均分支长度、网络平均分支数均明显下降,BYQZF能降低MPP+引起的细胞线粒体形态因子及网络结构的减少;敲减parkin后细胞线粒体的形态变圆。parkin敲减细胞用MPP+造模后其线粒体形态因子、网络平均分支长度、网络平均分支数均显著下降,其中线粒体网络分支平均长度较阴性质粒+MPP+组进一步显著变短,中药在parkin敲减后对MPP+诱导的PD细胞模型线粒体形态无明显改善。3.线粒体活性和功能的变化:MPP+处理可使转染阴性质粒的细胞线粒体活性、ATP水平和膜电位均明显下降,BYQZF能明显减少MPP+诱导的细胞线粒体功能的损伤。parkin敲减细胞用MPP＋造模后细胞线粒体活性、ATP水平和膜电位也显著降低,其中parkin敲减＋MPP+组较阴性质粒＋MPP＋组线粒体活性、膜电位均有明显下降,而中药在parkin敲减后只能明显增加MPP+诱导的PD细胞模型ATP水平,对线粒体的膜电位无明显改善作用。实验三结果:1.PINK1和Parkin蛋白的表达:中药BYQZF能显著拮抗MPP+处理后细胞PINK1和Parkin蛋白表达的显著下降;敲减parkin后Parkin蛋白表达显著下降而PINK1蛋白表达的无明显变化;parkin敲减细胞用MPP+造模后PINK1和Parkin蛋白表达水平明显下降;BYQZF可提升Parkin敲减+MPP++中药组PINK 1蛋白表达,但对该组Parkin蛋白表达无明显改变。2.Parkin蛋白定位关系:中药BYQZF能在一定程度上拮抗MPP＋引起的细胞Parkin与PINK1蛋白、Parkin与线粒体共定位系数的显著提高;敲减parkin后Parkin与PINK1蛋白、Parkin与线粒体共定位系数的均明显增加;而中药BYQZF对敲减parkin和MPP+引起的细胞Parkin与PINK1蛋白、Parkin与线粒体共定位系数的提高无明显抑制作用。3.线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1及线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达:MPP+可使模型组细胞线粒体融合蛋白Mfn1/2及OPA1的表达水平下降,分裂蛋白Drp1和Fis1表达水平明显增加;而中药BYQZF能拮抗MPP+造成的线粒体相关分裂融合蛋白的变化;敲减parkin后融合蛋白Mfn2表达减少,分裂蛋白Drp1和Fis1的表达增加;敲减parkin后用MPP+处理可使细胞融合蛋白Mfn1/2的表达水平下降,分裂蛋白Drp1和Fis1表达增加,中药在敲减parkin后对其融合蛋白Mfn1/2及分裂蛋白Drp1和Fis1表达无明显改变,但可提高融合蛋白OPA1的表达。结论补阴牵正方通过Parkin对PD细胞模型发挥保护作用对PD细胞模型发挥保护作用,其机制可能是增加细胞内Parkin的表达,调节PINK1蛋白募集Parkin蛋白转位于线粒体,并进一步影响线粒体分裂和融合蛋白的表达,拮抗MPP+造成的线粒体分裂,维持线粒体的动态平衡,改善线粒体的形态和功能。