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H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）自1992年在我国广东省鸡群中发现以来,已蔓延至全国大多数地区,呈地方流行性,难以彻底根除。经过多年的遗传进化,H9N2亚型AIV的致病性和传播性不断增加,给家禽养殖业造成严重的经济损失。此外,H9N2亚型AIV可以突破种间屏障直接感染哺乳动物包括人;并提供内部基因给其他亚型AIV产生如H5NX、H7N9、H10N8等人兽共患的新型AIV。因此,H9N2亚型AIV对公共卫生具有潜在威胁。近年来,虽然我国H9N2亚型AIV优势基因型仍然是G57或S基因型,但已有研究表明H9N2亚型AIV各基因片段发生了适应性变异,导致其跨宿主传播能力以及对哺乳动物的致病性增强。尤其是PB2基因上的一些适应性变异能增强病毒在哺乳动物中的复制和致病性。因此,有必要对H9N2亚型AIV进行定期流行病学监测、遗传进化及PB2基因关键分子标记的分析。本研究对2018年10月至2020年1月期间我国华东地区活禽交易市场和养鸡场的禽类进行每月流行病学监测,对H9N2亚型AIV全基因组进行遗传进化分析,并对PB2基因适应性分子标记对病毒在细胞内复制和聚合酶活性的影响进行分析。1华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查2018年10月至2020年1月,在华东地区活禽市场共采集1291份泄殖腔和喉头样品。通过SPF鸡胚培养和血凝血抑试验鉴定出408份AIV和NDV 阳性样品,病毒阳性样品占总样品数比例为31.58%（408/1291）。其中H9N2亚型AIV阳性样品178份（13.78%,178/1291）。同时,在养鸡场临床样品中分离鉴定105株H9N2亚型AIV,共获得H9N2病毒283株。在活禽市场408份阳性样品中,H9N2亚型AIV占比位居第一（43.63%,178/408）,其次是 H5 亚型（31.86%,130/408）、H3 亚型（15.68%,64/408）、NDV（7.35%,30/408）等。2018.10-2020.1 期间 H9N2 分离率（13.08%-14.5%）明显高于 2011.7-2016.9 期间分离率（0.21%-0.78%）,与 2016.10-2018.9（8.49%-15.12%）分离率没有明显差异。H9N2亚型AIV的主要宿主依旧是鸡（97.19%,173/178）;病毒样品的来源主要是华东地区江苏、山东和安徽等地;H9N2亚型AIV在炎热的夏季平均分离率达11.98%,无明显季节性差异。2华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征从H9N2分离株中选择277株进行HA和NA基因测序,获得277条HA基因、226条NA基因序列,根据HA和NA基因遗传进化结果选择55个代表性分离株进行全基因组测序,并运用MEGA 7.0最大似然法（Maximum Likelihood,ML）绘制全基因遗传发生树。分析结果显示,所有分离株的HA基因和NA基因均由病毒A/Duck/HongKong/Y280/97演化而来,分别分布在calde 15和calde 2;内部基因PB2基因和M基因由病毒A/Quail/HongKong/G 1/97演化而来,分别分布在clade 8和calde 3;PB1基因、PA基因、NP基因和NS基因由A/Chicken/Shanghai/F98/98演化而来,分别分布在clade 5、clade 7、clade 6和calde 7,因此分离到的H9N2亚型AIV毒株均属于S或G57基因型。其中HA基因已出现一个新的分支Group 3,该分支仅包含2018年末和2019年的毒株。所有毒株的HA蛋白均发生了影响病毒受体结合特性的第226位谷氨酰胺（Gln,Q）突变为亮氨酸（Leu,L）。大多数分离株（61.5%,139/226）NA基因与WJ57/12相似具有5个潜在糖基化位点,其余分离株有4个（25.67%,58/226）或6个（12.83%,29/226）潜在糖基化位点。聚合酶蛋白复合体发生多个与哺乳动物宿主适应性相关氨基酸位点,如 PB2 V147I（54/55）、A184T（50/55）、I292V（40/55）、A588V（53/55）,PB1 M317V（36/55）,PAK356R（50/55）、S409N（54/55）等,说明近两年H9N2病毒对哺乳动物宿主适应性不断增强的趋势。3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究根据NCBI数据库下载和实验室测序获得的PB2基因,比较H和S基因型毒株PB2基因序列,筛选出8个适应性变异位点（H→S）:V147I、A184T、R353K、R389K、S590G、T598V、L648V和V661A。基于H9N2/S代表株AH320反向遗传平台,分别对PB2不同结构域进行组合突变,检测其聚合酶活性。结果显示,AH320PB2 I147V、T184A两个位点组合突变和单点突变模式下的聚合酶活性和病毒复制滴度均降低,其中AH320-I147V+T184A组合突变导致的聚合酶活性降低最为显著。同时,与母本毒AH320 相比,在病毒感染 24h,AH320-I147V、AH320-T184A 和 AH320-I147V+T184A突变毒显著降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA表达量以及PB2蛋白、NP蛋白的表达水平。结果表明,PB2蛋白适应性变异147、184是影响S基因型H9N2毒株在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸。在2018-2020年期间,S（或G57）基因型的H9N2病毒仍然是华东地区活禽市场中AIV的主要亚型。HA蛋白和聚合酶复合体蛋白PB2,PB1和PA均显示出更多的哺乳动物适应性分子标记。此外,研究表明PB2蛋白147、184是影响S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸位点。