研究背景近年来,随着全球逐渐老龄化,骨性关节炎(osteoarthritis,0A)已经成为严重影响人们生活质量的一大问题。OA的主要特征性表现是关节软骨的逐渐退变以及周围相关组织的炎性化。目前OA的发病原因尚不明确,其治疗多数以使用非甾体抗炎药缓解疼痛状态以及关节置换术为主。研究表明,正常的关节软骨细胞、软骨基质及软骨下骨的合成与分解代谢存在处于稳态,当这种稳态失衡时,细胞外基质降解和增生不良,软骨细胞过度凋亡,最终引起整个关节软骨的退变。因此,维持和改善关节软骨细胞的活性以及抑制关节周围炎性反应是预防和非手术治疗OA的关键点。炎性反应是OA的一个重要特点,贯穿发生在OA的各个阶段。促炎细胞因子在软骨、滑膜和软骨下骨中表达的增加被认为与OA的发生和发展有密切关系。当收到炎性信号刺激时,相关炎性依赖性反应以及胱天蛋白酶(主要是胱天蛋白酶-1,caspase-1)被激活,它清除IL-1和IL-18的无活性前体,并刺激其分泌。近年来的研究发现,在骨关节炎的炎性反应中,细胞自噬(Autophagy)扮演着重要的角色。细胞自噬(Autophagy)是真核细胞维持细胞内稳态的一项关键性机制。其作用方式是通过溶酶体来完成对胞质蛋白和细胞器的生理性降解。目前已知自噬过程根据其传递方式的不同可分为三种类型:微自噬、巨自噬以及伴侣蛋白介导的自噬。伴侣蛋白介导的自噬仅在哺乳动物中出现,它参与单个可溶性蛋白质的降解。巨自噬和微自噬的发生范围很广,包括哺乳动物,植物和真菌在内的真核生物细胞质部分的降解,还包括细胞器的降解。其中,巨自噬被认为是自噬的主要类型,也是目前被研究最为广泛的自噬类型。它是由双(或多个)膜结合的液泡所介导的高度保守的过程,主要用于清除受损的细胞器或未被使用的蛋白质。这一过程在正常的生理状态下高度保守,但在受到氧化应激、应力刺激等细胞因素诱导时也可出现。近年研究发现,在OA动物模型中,维持细胞自噬水平的稳定对软骨细胞十分重要。人们在健康软骨的浅层细胞中发现自噬相关蛋白BECN1和MAP1LC3呈现高表达。在软骨退化初期,OA软骨细胞和软骨中的自噬增加。更为重要的是,自噬能够通过调节细胞凋亡和活性氧(ROS)的作用来影响OA风险基因的表达。自噬能够促进氧化应激作用而导致的多蛋白炎症复合物的合成,即炎性小体的合成。O3在常温下可以迅速分解成O2和氧原子,进而与体内的其他因子发生反应生成脂质过氧化物(Lipidhydroperoxides,LOPs)和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)。ROS被认为具有抗炎和镇痛的作用,对骨关节炎、软组织疼痛等疾病有缓解效果。已有研究报道通过关节腔注射低浓度O3可以对软骨细胞产生保护作用,但是其具体作用机制尚不明确。除了炎性刺激外,机械负荷是OA发生的另一个主要因素。应力是生物体接收的主要外界信号之一,无时无刻不在影响着机体,因此研究生物力学信号在软骨退变过程中的作用就显得十分必要。生物力学构成了软骨的重要外环境,一方面,适宜的力学信号可以帮助软骨的维持和修复,另一方面异常的力学信号可能导致软骨发育障碍或软骨损伤。临床中人们发现,对于膝关节OA的患者,一个明显的现象就是胫骨平台内侧承受过大的压力,患者膝关节内侧疼痛明显,内侧关节软骨磨损。因此目前临床上针对OA保膝治疗的手术方法主要是胫骨或腓骨截骨来代偿失衡的应力。机械应力负荷对OA的影响十分复杂。应力负荷可以改变骨的微环境,一方面,适当的应力负荷有助于骨稳态的维持,另一方面,异常的应力负荷会导致骨生成及骨吸收的平衡被打破,进而引起病理性变化。在骨关节炎中,异常的血管生成可导致OA进展,软骨下骨的异常血管生成以及血管侵入骨-软骨接合处是人类骨关节炎的病理变化之一。通过使用兔骨关节炎模型,有学者观察到软骨下骨的血管生成活性在OA的早期到进展阶段达到峰值,在OA的晚期逐渐下降到正常水平,提示OA与血管生成之间存在着密切联系。血管由多种类型的细胞组成,其中内皮细胞在血管形成和血管生成过程中发挥着重要的调节作用。最近的研究已经在小鼠骨骼系统中鉴定出一种新型的血管亚型,称为H型血管,其特征在于CD31(血小板内皮细胞粘附分子)和Endomucin(细胞表面粘蛋白)的高表达(CD31hiEmcnhi)。已经观察到这种特定的血管亚型可维持骨骼中的骨祖细胞,在发育和修复过程中耦合血管生成和成骨,并且密度会随着年龄的增长而下降。血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)于1974年被首先报道,它是贮存于血小板α颗粒中的一种肽类调节因子。因其来源于血小板并且能够刺激组织细胞增长而得名。PDGF-BB是PDGF家族中的趋化因子和促有丝分裂因子,对于促进各种间充质细胞(例如内皮祖细胞和间充质干细胞)的迁移,增殖和分化,以促进血管生成和成骨作用至关重要。有学者发现破骨前体细胞是骨髓和外周血中PDGF-BB的主要来源。这一发现支持了先前关于PDGF-BB通过未成熟的非吸收性破骨细胞被分泌的报道。破骨前体细胞衍生的PDGF-BB通过与其受体PDGF受体β(PDGFR β)结合,促进了间充质干细胞和骨髓内皮细胞的迁移和分化,并触发了促分裂原活化的激酶(mitogen-activated kinase)和磷酸肌醇-3 激酶-Akt 信号级联(phosphoinositide-3 kinase-Akt signaling cascade)。有学者的研究证实破骨细胞分泌的PDGF-BB在偶联血管-骨生成过程中发挥着重要作用。他们发现在小鼠骨质疏松(去卵巢)动物模型中,破骨前体细胞分泌的PDGF-BB减少并藕联引起H型血管数量减少,从而导致骨平衡被打破引起骨量丢失。而应用组织蛋白酶K抑制剂干预骨质疏松(去卵巢)小鼠可以增加破骨前体细胞数量并增加H型血管形成,促进骨形成。综上,作为影响骨关节炎的发生的两个重要因素,我们设计了以下研究来初步探索炎性反应引起的细胞自噬以及应力负荷引起的成血管成骨变化与骨关节炎之间的关系。第一部分氧化剌激对骨性关节炎软骨自噬的影响研究目的建立大鼠膝关节OA模型,观察氧化刺激对软骨细胞自噬及炎症之间的关系。研究方法1.动物模型及分组Wistar大鼠随机分为3组:分别向Sham组和MIA组大鼠右膝关节内注射0.9%NaCl 50 μ L和3mg MIA50 μL;对于MIA+O3组,右膝关节腔注射MIA后的第7、14、21 天(d)分别给予 30 μ g/mL 03 0.5mL 干预。2.大鼠行为学观察测定缩爪阈值(MWT)和缩爪不应期(PWL)。观察行为学改变,并分别在MIA注射前 1 d、注射后 1、4、7、14、21、28 d 测定大鼠 MWT(Von Frey Hairs test)和 PWL。3.HE染色和番红-固绿染色观察软骨变化注射28d后完成行为学测定后,麻醉处死,取右膝关节进行HE染色和番红-固绿染色,进行Mankin评分。4.EILSA测定炎症相关因子TNF-α和IL-6的浓度。在MIA注射28d并完成行为学测定后,麻醉后抽取外周血5mL,离心后取出上清待测。分别加入标准品、待测上清和抗体进行孵育,使用酶标仪检测OD值,并计算IL-6和TNF-α的浓度。5.免疫组化检测MMP-13、collagen-2、LC3Ⅱ和p62的表达免疫组化法观察软骨自噬相关蛋白MMP-13、collagen-2、LC3Ⅱ和p62的表达。6.免疫组化检测p-AMPK的表达。在MIA注射28d并完成行为学测定后,麻醉处死,4%多聚甲醛灌注后取右膝关节和腰Ⅱ-腰Ⅳ脊髓节段,免疫组化法观察关节软骨和脊髓中p-AMPK的表达。研究结果我们观察到,对于MIA组大鼠,MIA注射后1 d,与Sham组相比,可以观测到MIA组大鼠活动度明显降低。其右下肢着地时间较Sham也明显缩短,同时舔足次数增加,跛行次数增多。膝关节活动度较Sham组减小,灵活性降低。造模前1d,各组大鼠MWT无明显差异(P>0.05)。在MIA注射后(1、4、7d、14 d、21 d、28 d),MIA 组 MWT 比 Sham 组明显降低(P<0.01)。在初期O3干预后(1d-7 d),MIA+O3组和MIA组的MWT变化相似,然而在O3干预后(7 d-21 d),MIA+O3组的MWT回升并在第21d后明显高于MIA组(P<0.01),不过仍然低于Sham组。PWL的结果与MWT结果相似。Sham组的大鼠右膝关节面完整平滑,周围无软组织明显增生,未见明显出血点。MIA组大鼠右膝的关节面粗糙、缺损,可见软骨破坏,周围滑膜样软组织增生,关节面可见多个散在出血点。MIA+O3组大鼠右膝的关节面较完整,周围无滑膜样软组织增生,未见明显软骨破坏。与Sham组大鼠的软骨层相比,MIA组大鼠的软骨表面变薄,着色不均匀,软骨细胞排列不整齐,细胞数量减少。而MIA+O3组大鼠的软骨层厚度较MIA组增加,着色尚均匀,软骨细胞排列序列可,细胞数量较Sham没有明显减少。Safranine O结果可见Sham组大鼠关节软骨染色清晰,软骨细胞排列整齐,细胞染色无明显减退。MIA组大鼠Safranine O染色减退,软骨结构紊乱,关节表面细胞数量增多。MIA+O3组大鼠Safranine O染色无明显减退,关节软骨结构无明显紊乱,关节表面细胞数量无明显变化。Mankin评分结果显示,MIA 组 Mankin 评分(8.0±1.1038)明显高于 Sham 组(P<0.01)。而 MIA+O3组Mankin评分(4.9±0.8944)虽高于Sham组,但明显低于MIA组(P<0.01)。与Sham组相比,MIA组collagen 2表达明显降低(P<0.01)。而在O3干预后可使collagen 2表达高于MIA组(P<0.05)。MIA组的MMP-13表达较Sham组表达明显升高(P<0.01),同时,03干预可以减低这升高作用,MMP-13的表达较MIA组明显降低(P<0.01)。MIA干预后的大鼠凋亡相关因子p62表达显著高于Sham组(P<0.01),在O3干预后,p62的表达较MIA组明显减少(P<0.01)。与Sham组大鼠相比,MIA组大鼠自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达明显减少(P<0.05)。与Sham组大鼠相比,MIA组大鼠的p-AMPK表达明显下降(P<0.01)。而MIA+O3组大鼠软骨中p-AMPK水平与MIA组相比明显升高(P<0.01)。在脊髓中,与Sham组大鼠相比,MIA组大鼠p-AMPK表达水平下降(P<0.05),而MIA+O3组大鼠脊髓p-AMPK表达明显升高(P<0.05)。与Sham组相比,MIA组大鼠外周血中IL-6浓度明显升高(P<0.01),TNF-α的浓度也明显升高(P<0.01)。在O3干预后,外周血IL-6浓度明显低于MIA组(P<0.01),也低于Sham组。对于TNF-α的浓度,MIA组与Sham组相比明显上升(P<0.01),在应用O3干预后显著下降(P<0.01)。结论氧化刺激(膝关节腔O3干预)可以降低大鼠血清炎性相关因子IL-6和TNF-α的浓度,减少关节软骨中MMP-13的表达并降低collagen-2的降解,延缓OA软骨退变。同时可以上调软骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达并抑制p62表达,其作用可能与AMPK信号通路相关。第二部分应力通过成血管-成骨偶联因子对骨关节炎的影响研究目的本研究使用应力/失应力作用下的动物模型,并利用条件性基因敲除小鼠(Trap-Cre;Pdgfbfl/fl),探索机械应力与破骨细胞分泌PDGF-BB诱导H型血管生成对骨关节炎的影响。研究方法1.构建基因敲除小鼠:我们将Trap-Cre小鼠与Pdgfbfl/fl小鼠杂交,以生成Trap-Cre;Pdgfbfl/fl小鼠(在本文中称为“Pdgfb-/-”)。通过PCR分析确定小鼠的基因型。2.建立应力/失应力动物模型:建立应力负荷动物模型,分别对WT,Pdgfbfl/fl以及Pdgfb-/-组小鼠进行应力试验。将各组小鼠的右后肢安装在特殊设计的固定装置上进行轴向压缩,并对尺骨也进行应力试验。建立失应力动物模型,采用后肢悬吊法,将小鼠分为3组:正常负荷组,后肢悬吊(HLS)组和HLS+组织蛋白酶K(CatK)抑制剂L-006235组(HLS+L-235),悬吊4周。对于HLS+L-235组每天用载体或L-235(50mg kg-1 b.w.)干预小鼠,持续4周。3.Micro-CT分析骨变化:对小鼠骨组织进行micro-CT扫描,并通过Skyscan软件进行重建并分析。测量体积分数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数目(Tb.N),骨小梁分离度(Tb.Sp),骨皮质厚度(Ct.Th),骨内膜周长(Es.Pm)和外周长(Ps.Pm)。4.动态骨形成实验:采用钙黄绿素荧光标记法对各组小鼠骨组织的生长情况进行观察。5.免疫荧光染色(Immunofluorescence):免疫荧光染色观察各组骨组织中CD31、endomucin、TRAP、PDGF-BB 的表达情况。研究结果我们成功建立小鼠的机械应力\失应力模型,结果表明与未受应力的骨骼相比,应力刺激后的骨具有显著增加的矿物质附着率(MAR)和骨骼形成率(BFR),同时皮质骨厚度(Ct.Th)和骨膜外周长(Ps.Pm)也有明显增加,证实了应力刺激可以促进骨的生长。我们通过对TRAP和PDGF-BB进行免疫共染,分析了表达PDGF-BB的骨骼的骨膜中破骨细胞的数量,结果表明,应力刺激增加了胫骨骨膜中TRAP/PDGF-BB细胞的数量。此外,通过CD31和Emcn的免疫共染色鉴定出H型血管,结果表明与未受应力的肢体相比,应力负荷后骨膜中H型血管的数目同样增加。而对于Pdgfb选择性基因敲除小鼠,应力负荷后不能使骨量明显增加,H型血管的数量也没有明显变化。同时还进行了失应力实验(HLS),失应力后骨量的减少体现在矿物质附着率(MAR)、骨骼形成率(BFR)、皮质骨厚度(Ct.Th)、骨膜外周长(Ps.Pm)的减少。应用L-235则可以逆转这种变化。结论机械应力导致的小鼠骨量的变化与破骨细胞分泌PDGF-BB诱导H型血管的生成有关。应用组织蛋白酶K抑制剂可以恢复失应力导致的骨量丢失。针对这种应力后成血管成骨变化的研究可能是未来骨性关节炎治疗的新方向。