研究背景航天飞行后航天员通常发生心血管功能的失调,表现为重返地面后的立位耐立不良和运动能力的下降,严重影响航天员的身体健康,然而由于航天飞行引起心血管功能失调的机制尚未完全阐明,目前依旧缺乏有效的对抗措施。先前研究表明微重力环境引起大鼠的外周血管系统发生区域特异性的重塑,表现为心水平以上的动脉发生管壁增厚、收缩功能增强的改变,而心水平以下的动脉发生管壁萎缩、收缩功能减弱的改变,外周血管的重塑可能是造成心血管功能失调的重要原因。多种分子机制参与调控微重力环境诱导的血管重塑过程,包括e NOS-NO、局部肾素-血管紧张素、炎症反应、氧化应激和多种离子通道等。近年来关于似昼夜节律的研究日益深入,越来越多的研究表明心血管系统和似昼夜节律之间联系密切,不仅心血管系统的生理功能表现出似昼夜节律性,似昼夜节律的紊乱更是促进心血管系统的病理性结构和功能的改变。然而,微重力环境下心血管系统的重塑中是否存在似昼夜节律异常的参与,目前尚未见报道,本研究进行了探讨。L型钙通道(Cav1.2)是细胞外钙进入胞内的重要途经,在肌肉兴奋收缩偶联中起着关键作用,并且密切参与动脉平滑肌细胞表型转化、增殖和凋亡的调控。本教研室前期工作已经表明模拟失重可引起大鼠脑动脉Cav1.2表达的上调,并且高表达的Cav1.2和脑动脉的重塑密切相关。研究表明,Cav1.2可作为时钟基因的效应分子参与调控视网膜对昼夜明暗光线环境的适应,Cav1.2的表达和功能均表现出似昼夜节律性,然而Cav1.2的昼夜节律性在心血管系统中的作用尚不清楚,因此我们观察了脑动脉Cav1.2表达的似昼夜节律性以及模拟失重后的改变,以期阐明模拟失重引起心血管功能似昼夜节律紊乱可能的分子机制。Cav1.2表达是如何具有似昼夜节律的呢?已有研究表明micro RNA(mi RNA)参与Cav1.2似昼夜节律的产生。mi RNA是一种调控性的非编码RNA,主要通过和m RNA互补配对结合引起m RNA的降解或者抑制翻译过程。查阅文献明确目前已证实有8中mi RNA可调控Cav1.2的蛋白表达,随后进行筛选,最终确定mi RNA-103可能是脑动脉内Cav1.2蛋白表达产生节律性的关键分子,并且进一步证实mi RNA-103表达的异常可引起下游靶基因Cav1.2的似昼夜节律性异常。实验目的1.明确模拟失重大鼠心血管功能的似昼夜节律是否发生紊乱。2.明确模拟失重大鼠时钟基因及下游钟控基因Cav1.2的表达节律性的改变。3.探讨mi RNA-103对Cav1.2节律性的调控作用。实验方法1.采用尾部悬吊模型模拟微重力对心血管的影响。模拟失重28天后测量大鼠尾动脉血压和心率的昼夜波动,观察大鼠心血管系统节律性的改变。2.于夜间1点和白天13点分别测定大鼠脑动脉的血管紧张度和腹主动脉的收缩反应性,观察白天和夜晚的差异,以及模拟失重28天后昼夜差异的变化。3.分别于一天中的8点、12点、16点、20点、24点、4点六个时间点取材视交叉上核、脑动脉,测定时钟基因Per2、Bmal1、dbp和Cav1.2不同时间点的表达水平。4.利用血清休克的方法在细胞水平诱导似昼夜节律的产生,50%马血清处理平滑肌细胞A7r5两小时,以血清休克开始为0点,每4小时裂解细胞提取蛋白检测时钟基因的表达。5.根据表达具有节律性和模拟失重后表达改变两个条件筛选可能参与调控Cav1.2节律性的mi RNA。6.将筛选出的mi RNA转染平滑肌细胞后,进行血清休克处理,观察Cav1.2表达的节律性变化。7.数据采用Graph Pad Prism version 5.0程序进行统计学分析,两组数据间比较采用t检验,两组以上数据间比较采用方差分析(ANOVA)或重复测量方差分析。实验结果表示为平均数±标准误,P<0.05为差异有显著性。实验结果1.明确模拟失重大鼠心血管功能的似昼夜节律是否发生紊乱。1)模拟失重引起大鼠心血管系统一般功能似昼夜节律紊乱。对照组大鼠的血压和心率均表现为昼低夜高,具有明显的似昼夜节律性,而悬吊组大鼠心率和血压的似昼夜节律性出现异常。在白天,悬吊组大鼠的心率高于对照组(P<0.05),而两组大鼠的收缩压、舒张压没有统计学差异;在晚上,悬吊组大鼠的心率高于对照组(P<0.05),而悬吊组大鼠的收缩压、舒张压均低于对照组(P<0.001,P<0.05)。而悬吊组大鼠心率、收缩压、舒张压的一天内的波动幅度均显著低于对0照组(P<0.001,P<0.01,P<0.001),提示模拟失重引起大鼠心血管一般功能的似昼夜节律性异常,表现为振荡幅度的缩小。2)模拟失重引起大鼠腹主动脉收缩反应性的昼夜差异缩小。在白天和晚上两个时间点,悬吊组大鼠的腹主动脉对去甲肾上腺素诱导的收缩反应性均显著低于对照组(P<0.05,P<0.001);同时,对照组大鼠腹主动脉收缩反应性存在昼夜差异,而悬吊组腹主动脉的收缩反应性的昼夜差异显著降低(P<0.001)。3)模拟失重引起大鼠大脑中动脉血管紧张度的昼夜差异缩小。在白天和晚上两个时间点,悬吊组大鼠的大脑中动脉的紧张度均高于对照组(P<0.05,P<0.05);同时,对照组大鼠大脑中动脉的紧张度存在昼夜差异,而悬吊组大脑中动脉的紧张度昼夜差异显著降低(P<0.001)。2.明确模拟失重大鼠时钟基因及下游钟控基因Cav1.2的表达节律性的改变。1)模拟失重引起大鼠脑动脉Cav1.2表达似昼夜紊乱。对照组大鼠脑动脉Cav1.2的蛋白表达水平呈现出昼低夜高的趋势,具有似昼夜节律性,而悬吊组大鼠脑动脉Cav1.2蛋白表达水平的昼夜差异改变。在白天,悬吊组大鼠脑动脉Cav1.2的表达水平高于对照组(P<0.01);而在晚上两组的差异消失。同时悬吊组大鼠脑动脉Cav1.2蛋白表达水平的昼夜差异显著小于对照组(P<0.05)。而在转录水平,两组大鼠的脑动脉Cav1.2m RNA的相对表达水平均无表现出昼夜差异,无论白天还是夜晚悬吊组大鼠的Cav1.2m RNA均高于对照组(P<0.01,P<0.05)。2)模拟失重引起大鼠外周钟(脑动脉)时钟基因似昼夜节律性表达紊乱。对照组大鼠脑动脉的时钟基因Per2、Bmal1和dbp的蛋白和m RNA表达水平均表现出振荡性,而悬吊组大鼠时钟基因表达的振荡幅度显著缩小。3)模拟失重引起大鼠中枢钟(视交叉上核)时钟基因似昼夜节律性表达紊乱。对照组大鼠视交叉上核的时钟基因Per2、Bmal1和dbp的蛋白和m RNA表达水平均表现出振荡性,而悬吊组大鼠时钟基因表达的振荡幅度显著缩小。3.mi RNA-103参与调控Cav1.2蛋白表达似昼夜节律性的产生和紊乱。1)血清休克能够诱导平滑肌细胞A7r5时钟基因的振荡性表达。2)通过节律性和悬吊后表达变化双重筛选,确定mi RNA-103可能参与调控模拟失重脑动脉重塑过程中Cav1.2表达节律性异常的调控。mi RNA-103的表达具有节律性,而经过模拟失重后mi RNA-103的表达下调(P<0.01),且节律性消失(P>0.05)。3)在A7r5细胞内转染mi RNA-103 mimic后,Cav1.2表达下调(P<0.01),转染mi RNA-103 inhibitor后Cav1.2表达上调(P<0.01)。随后转染mi RNA-103mimic、inhibitor至A7r5细胞,并诱导其表现出节律性,结果转染mi RNA-103 mimic后A7r5细胞Cav1.2表达下调,同时振荡消失,而对转染mi RNA-103 inhibitor的后发现Cav1.2表达上调,同时振荡幅度也增加。结论实验结果表明结果表明,模拟失重引起大鼠心血管系统的似昼夜节律紊乱,血压和心率的昼夜差异显著降低。同时时钟基因的表达也发生紊乱,下游的钟控基因Cav1.2的表达节律性也发生紊乱,并解释了血管功能昼夜差异消失的原因。另外,mi RNA-103能够负性调控Cav1.2的表达,mi RNA-103表达的节律紊乱可能介导了Cav1.2节律的紊乱。