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第一部分Caspase-3在大鼠原位阻断肺缺血再灌注损伤模型中的表达目的建立大鼠原位阻断肺缺血再灌注损伤模型,并探讨caspase-3基因在不同再灌注时间点在大鼠肺组织中的表达情况。方法夹闭大鼠左侧肺门以阻断左肺通气血流,缺血时间为1h,设置不同的再灌注时间点0、0.5h、1h、2h、6h和12h,①应用real-time PCR和western blot的方法检测不同再灌注时间末大鼠肺组织中caspase-3的表达；②检测不同再灌注时间末大鼠左肺静脉血氧分压(PaO2)及二氧化碳分压(PaCO2)情况；③采用湿干重比(W/D)判断不同再灌注时间末大鼠肺组织的水肿情况；④采用TUNEL法检测不同再灌注时间末大鼠肺组织中肺泡细胞凋亡情况。结果①随着再灌注时间的延长,大鼠肺组织中caspase-3的表达逐渐增加,再灌注2h时达到高峰,随后逐渐下降,mRNA水平及蛋白水平结果相同;②再灌注2h时大鼠左肺静脉血PaO2降低最为明显,后逐渐升高；PaCO2在再灌注2h末升高最为明显,后逐渐下降；③再灌注2h时大鼠肺组织W/D比值在所有实验组中最高,随后该比值逐渐下降；④再灌注2h时大鼠肺组织中肺泡细胞凋亡最为明显,阳性细胞凋亡率最高。结论再灌注2h时大鼠肺组织中肺泡细胞凋亡最为严重,肺组织水肿最明显,肺功能损害最严重,caspase-3的表达最强。第二部分构建针对大鼠caspase-3基因的RNAi质粒载体并筛选出有效的干扰靶点目的构建针对目的基因caspase-3表达的RNAi DNA质粒载体,并筛选出有效的干扰靶点。方法①针对目的基因caspase-3基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计3-4个RNA干扰靶点序列；合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端；选用pGCsi-U6/Neo/GFP质粒载体,并用Bam HI和HindⅢ进行酶切；将合成的双链DNA oligo与pGCsi质粒连接；②制备细菌感受态细胞,将连接好的产物转入该细胞,并对长出的克隆进行PCR鉴定,在进行测序对比后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的caspase-3 RNAi质粒载体；③对构建成功的caspase-3 RNAi质粒载体进行扩增,并抽提阳性质粒；④构建好含有caspase-3的表达克隆质粒和针对caspase-3不同干扰靶点的DNA载体质粒,根据Invitrogen公司的lipofectamine 2000使用说明共转染培养好的NRK细胞,转染24h后荧光显微镜下观测转染效果,转染36-48h收集细胞抽提蛋白,采用western blot检测caspase-3蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。结果①设计了4个干扰靶点,分别为SD-704、SD-705、SD-706和SD-707,SD-NC为阴性对照,并与pGCsi-U6/Neo/GFP质粒成功连接；②经过测序对比,构建的4个针对caspase-3的RNAi质粒载体成功,并成功扩增和抽提；③经过检测,显示SD-704和SD-707两个干扰靶点的敲减效率较好。结论成功构建针对caspase-3基因的RNAi质粒载体,并筛选出有效的干扰靶点。第三部分Caspase-3 RNAi质粒载体传染大鼠原位阻断肺缺血再灌注损伤模型目的用caspase-3 RNAi质粒载体转染大鼠肺缺血再灌注损伤模型,并观察其体内caspase-3的表达情况。方法①三组动物在实施缺血再灌注前48h,分别经气管给予合成的caspase-3 shRNA、scrambled shRNA以及RNase-free D5W solution;②应用real-time PCR、western blot和免疫组化检测再灌注2h后各实验组肺组织中caspase-3的表达；③检测再灌注2h末不同实验组大鼠左肺静脉血氧分压(PaO2)及二氧化碳分压(PaCO2)情况；④采用湿干重比(W/D)判断再灌注2h末不同实验组大鼠肺组织的水肿情况；⑤采用TUNEL法检测再灌注2h末不同实验组大鼠肺组织中肺泡细胞凋亡情况；⑥透射电镜观察不同实验组大鼠肺组织中肺泡细胞的凋亡情况。结果①给予caspase-3 shRNA后大鼠肺组织中caspase-3表达较之给予scrambled shRNA组和给予RNase-free D5W solution组明显减少；②caspase-3 shRNA组大鼠左肺静脉血PaO2较另两组明显升高,PaCO2明显下降,肺组织水肿明显减轻；③caspase-3 shRNA组大鼠肺组织肺泡细胞中细胞凋亡明显减轻,阳性细胞凋亡率明显减少。结论经气管给予caspase-3 shRNA后大鼠肺组织中caspase-3表达减少,肺组织中细胞凋亡减轻,肺组织水肿减轻,肺功能得到改善。