前言:胶质瘤是中枢神经系统最常见的颅内原发性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的50%以上,恶性程度高、侵袭能力强,并伴随较高的复发率和死亡率,特别是胶质母细胞瘤（GBM）恶性程度最高。目前胶质瘤的标准化治疗方案是手术最大程度切除,术后联合放化疗的Stupp方案,但治疗效果仍不尽如人意。传统的胶质瘤临床前研究大多只关注胶质瘤细胞本身,而忽略了胶质瘤微环境与肿瘤细胞间的相互调控,同时缺乏了符合体内的三维空间和有序排列。课题组前期研究发现体外生物3D打印的脑肿瘤模型增强了肿瘤细胞的干性,同时也增强了对于化疗药物的抵抗性,提示了生物3D打印的肿瘤模型对于研究肿瘤细胞行为学和肿瘤耐药的巨大潜力。本研究针对胶质瘤微环境中两大非肿瘤细胞组分,间充质干细胞及免疫细胞组分,细化探讨了在生物3D打印的胶质瘤微环境中,胶质瘤细胞与两种不同微环境细胞的互相调控以及胶质瘤微环境整体对胶质瘤进展的不同影响,旨在为体外三维胶质瘤微环境的建立和胶质瘤体外模型的多元化提供新的思路,达到通过体外三维模型实现研究肿瘤细胞和微环境细胞互相调控机制和药物筛选的目的。第一部分:体外3D模型研究胶质瘤细胞与间充质细胞互作目的:间充质干细胞作为肿瘤微环境中存在的组分,凭借其自身独有的趋瘤性,在胶质瘤治疗的临床前研究中时有提及并展现出一定的收益,但间充质干细胞本身对于肿瘤的进展或者抑制一直是科学争论的焦点问题,报道促胶质瘤和抑制胶质瘤的作用均有提及。本文报道一种体外构建的、呈三维排列的、间充质干细胞与胶质瘤细胞互作的模型建立,研究间充质干细胞对胶质瘤细胞的影响。方法:（1）自建立同轴挤出生物3D打印系统,同轴挤出制造壳-海藻酸钠/芯-GelMA材料包裹高密度细胞悬液的细胞线。其中外壳为2%海藻酸钠溶液包裹间充质干细胞或2%海藻酸钠溶液,内芯为GelMA包裹U87MG胶质瘤细胞,通过打印并交联形成壳-MSC/芯-U87MG或壳-无细胞/芯-U87MG的水凝胶纤;（2）使用活/死试剂和阿尔玛蓝试剂来评价打印后细胞的活性、增殖和抵抗化疗药物的能力,通过倒置显微镜和共聚焦显微镜观察细胞的大小和形态变化;（3）通过流式细胞仪和免疫荧光分析不同培养条件下U87MG细胞的CD133、CD105、OCT4、GFAP和Nestin蛋白表达;（4）提取不同培养条件下的U87MG细胞蛋白,使用Western blot检测与肿瘤侵袭相关的MMP2,与肿瘤进展有关的Notch1和与肿瘤EMT（上皮间质转化）有关的N-cadherin、Vimentin;（5）裸鼠体内注射细胞悬液验证不同环境中的U87MG的成瘤能力差异。结果:同轴生物打印平台构建的壳/芯水凝胶纤维在间充质干细胞的加持下,内芯的U87MG细胞明显地铺展开,展示出良好的空间网状结构,同时间充质干细胞提高了胶质瘤细胞的存活、增殖和化疗药物的抵抗能力,使U87MG细胞表达更多的Nestin、MMP2和Notch1。随着MSC细胞密度的增加,肿瘤细胞表达更多的N-cadherin和Vimentin,EMT能力与MSC的浓度呈正相关。最后我们发现,在成瘤能力的比较上,MSC加持的U87MG组能力强于没有MSC的组分。结论:本研究采用同轴挤压生物打印技术制备壳-MSC/芯-U87MG水凝胶微纤维,模拟间充质干细胞和细胞外基质组成的胶质瘤微环境。在这种微环境中,间充质干细胞在不接触U87MG的情况下具有促进肿瘤细胞侵袭的作用。与无间充质干细胞加持的芯-U87MG水凝胶微纤维相比,间充质干细胞可提高U87MG细胞的增殖、EMT、活性、侵袭、肿瘤发生和耐药能力,并维持其在壳-MSC/芯-U87MG微纤维中的干性。同时,我们发现了 GelMA是一种适用于内芯中观察肿瘤细胞形态、迁移和转移的生物材料,可以在体外建立同轴共培养的肿瘤微环境。该模型为体外肿瘤细胞与基质细胞共培养的研究提供了一个新的平台,以揭示非肿瘤细胞在体外细胞基质中的作用机制。第二部分:体外生物3D打印胶质瘤模型目的:通过生物3D打印的方法建立3D胶质瘤模型,评估生物3D打印胶质瘤细胞建立脑肿瘤模型的可行性;初步对比不同生物材料对于建立生物3D打印胶质瘤模型与2D培养模型的生物学特征和化疗敏感性的差异,为后续建立多元化多组份的胶质瘤微环境打下坚实的基础。方法:（1）建立以明胶/海藻酸钠为原料的水溶胶体系和以谷氨酰胺转氨酶（TGase）/氯化钙（CaCl2）为交联剂的生物打印的水凝胶材料体系;其中TGase交联明胶,CaCl2交联海藻酸钠;（2）建立以含有光引发剂（LAP）的甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）为原料的水溶胶体系,成型之后使用波长为405nm的蓝光交联;（3）建立以含有引发剂（LAP）的甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）/甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA）为原料的水溶胶体系,成型之后使用波长为405nm的蓝光交联;（4）使用迈普医学的多喷头生物3D打印机（LivPrintTM）打印6*5*4mm3的类脑形状的网格状水凝胶支架;（5）使用荧光活/死染色试剂来评估细胞在水凝胶支架上的活性及增殖能力,使用扫描电镜观察细胞在水凝胶支架中的形态结构;（6）流式分析胶质瘤干细胞在三维环境下的不同生物材料中和2D条件下胶质瘤干细胞表面标记物CD90、EMT相关基因CD44和肿瘤血管生成能力相关的CD105;（7）使用label free分析3D环境下的肿瘤分泌蛋白与2D条件下肿瘤分泌蛋白在种类和数量上的差异;（8）二代测序（NGS）进行生物信息学分析。结果:（1）生物3D打印的生物材料水凝胶支架体系,不论是明胶/海藻酸钠体系、GelMA体系或GelMA/HAMA体系均可见多级孔结构,其中GelMA/HAMA体系中的胶质瘤干细胞或胶质瘤细胞可以实现“早期逃逸”,即肿瘤细胞可以通过分泌基质金属蛋白酶（MMP）或其他物质消化细胞外基质,实现肿瘤细胞的侵袭;（2）U87MG细胞在GelMA/HAMA体系中的增殖能力强于单独GelMA和明胶/海藻酸钠体系;（3）GelMA/HAMA中的胶质瘤干细胞（GSC23）与2D培养和明胶/海藻酸体系中的GSC23相比,高表达干性标记物CD90和成血管能力标志物CD105;（4）生物3D打印的胶质瘤模型与2D模型相比,分泌更多的POSTN、CSF-1、TGF-b1和Vimentin等细胞因子和蛋白,上调了 82种蛋白和因子的分泌同时下调了 19种;（5）生物3D打印的胶质瘤细胞在缺氧相关基因、EMT相关基因、细胞迁移、连接、成血管能力等相关基因均有所增高,在DNA复制和细胞周期调控、增殖等方面的相关基因表达弱于2D培养环境。结论:借助生物3D打印技术,通过不同组份的水凝胶体系进行打印,这种体外形成的“类脑”3D胶质瘤模型可以更好地模拟体内肿瘤微环境,反应更为真实的胶质瘤生物行为学特点,其中以GelMA/HAMA为基质材料构建的三维肿瘤模型具有更强的增殖、侵袭、EMT等能力,为体外研究三维胶质瘤微环境、三维排列的肿瘤细胞体外生物行为学提供了新的研究平台。第三部分:生物3D打印胶质瘤免疫微环境及肿瘤细胞-肿瘤相关巨噬细胞在三维微环境中的相互作用目的:肿瘤微环境由肿瘤细胞、肿瘤干细胞、免疫细胞和间充质细胞等组成,目前的研究结果表明胶质瘤相关巨噬细胞对于胶质瘤的进展具有重要的调控作用,但基本都是在2D共培养的条件下或PDX模型中完成的相关临床前研究,无法很好的模拟体内肿瘤微环境。我们通过建立一个以生物3D打印为基础,以多细胞、多生物材料为填充物的体外胶质瘤微环境模型,实现模拟体内的胶质瘤微环境的目的,从而进行肿瘤细胞-非肿瘤细胞在三维微环境中互相作用的研究。方法:（1）通过第二部分的实验结果比较,选用GelMA/HAMA作为细胞外基质生物材料,使用迈普医学的多喷头生物3D打印机（LivPrintTM）打印6*5*4mm3的类脑形状的网格状水凝胶支架,其中底层、外层为种上巨噬细胞的基底,其余部分为胶质瘤细胞或胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞;（2）qPCR测定不同培养条件下的胶质瘤细胞/胶质瘤干细胞缺氧、干性、转化因子、体现侵袭能力的相关基因表达情况;（3）Western blot、流式、qPCR检测不同培养条件下的巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的相关蛋白表达情况;（4）label free分析不同分组的蛋白种类和数量的差异;（5）Elisa试剂盒检测判断造成巨噬细胞极化M2型能力不同的原因;（6）二代测序（NGS）进行生物信息学分析;（7）观察不同成分的胶质瘤微环境对于不同化疗药物的敏感程度差异。结果:（1）使用多喷头生物3D打印的三维胶质瘤微环境通过光固化可以在细胞培养的环境中保持稳定的形态和固定的结构,胶质瘤细胞（U87MG）/胶质瘤干细胞（GSC23）/胶质瘤相关巨噬细胞（GAM）在打印后的第5天均有较高的存活率（大于80%）;（2）Western blot检测M2型巨噬细胞极化能力体现的标记物精氨酸酶-1（Arginase-1）,U87MG/GSC23/GAM>GSC23/GAM>U87MG/GAM>GAM,qPCR检测Arg-1、IL-10、CD163三种M2型巨噬细胞表达标志物也是同样的结论,流式检测CD206的结果也基本一致;（3）三维微环境中加入了 GAM后,qPCR检测到肿瘤细胞/肿瘤干细胞表达更多的TGF-b1,STAT3,IL-1b,FGF2等与肿瘤进展正向相关基因,同时高表达MMP2,MMP9两种主要的基质金属蛋白酶基因,高表达VEGFR成血管相关基因;（4）在CSF-1和TGF-b1两种细胞因子分泌检测中,我们得到了相同的结论,微环境成分越复杂,细胞因子分泌的越多;（5）通过label free蛋白组学质谱比较蛋白分泌,我们发现了加入GAM后,整体的蛋白分泌更多的Vim,SPP1,CXCL8等,提示肿瘤细胞EMT和成血管能力在巨噬细胞的加持下进一步增强;（6）三维微环境对于BCNU和TMZ的化疗作用相较于DOX更为明显,且成分越复杂,对于化疗药物的抵抗力越强。结论:三维胶质瘤微环境的成分越复杂,极化M2型巨噬细胞的能力越强,同时被极化的M2型胶质瘤相关巨噬细胞进一步增强微环境中胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞的增殖、侵袭、上皮间质转化、成血管等能力,且复杂的微环境在体外具有更高的仿生性。生物3D打印的肿瘤微环境模型为研究三维环境中的肿瘤细胞-非肿瘤细胞的相互作用和药物的开发与筛选提供了全新的思路和良好的平台。