猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由于感染了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）从而引发的一种严重的病毒性传染病。PEDV属于冠状病毒科成员,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,1周龄内的仔猪感染PEDV后通常会在持续腹泻、呕吐3-4天后因脱水而死,日龄较大的猪通常会在1周后康复,育肥猪和母猪感染后也可能发生腹泻,也有不发生腹泻的,但是其精神状态较差,出现精神沉郁、厌食、喜卧、日渐消瘦等症状。7日龄仔猪感染后死亡率很高,育肥猪感染后会推迟出栏时间,增加了养猪的成本。随着近年来PEDV在许多国家的爆发,已经在全世界范围内给养猪业带来了巨大的危害。PED给养猪业造成巨大危害的主要原因是缺少高效的PEDV疫苗,而制备高效疫苗的基本条件是获得高滴度的病毒。目前生产PEDV疫苗所使用细胞系为Vero细胞,存在培养病毒滴度较低的缺陷,其中造成病毒滴度较低的主要原因是Vero细胞中存在以Ⅰ型干扰素为主的先天性免疫系统。基于上述研究背景,本研究为了提高PEDV的繁殖滴度,通过敲除Vero细胞的I型干扰素受体基因,并研究改造后的细胞系对PEDV复制的影响,以期能够提高了病毒的滴度,为疫苗开发奠定基础。1.构建质粒pX330-IFNR-sg RNA:把IFNAR1-F与IFNAR1-R退火后形成双链DNA与回收的线性化pX330质粒连接形成特异性打靶载体pX330-IFNR-sg RNA,连接产物转化进DH5α,挑取单菌落提取质粒并鉴定,选择测序正确的质粒扩大培养后提取无内毒素质粒。2.建立细胞系:把构建的质粒pX330-IFNR-sg RNA以及带有G418抗性标记的质粒转染进正常的Vero细胞,分别用G418浓度为200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的含10%血清的DMEM培养,最后挑选单克隆细胞,消化下来后扩大培养。提取单克隆细胞系基因组DNA,通过PCR鉴定和测序,成功获得了9个Ⅰ型干扰素受体敲除细胞系。3.I型干扰素受体缺失对PEDV增值特性的影响:以0.05 MOI PEDV GH株感染WT vero和IFNAR1^-/-vero细胞,分别在24、48、72、96 hpi收毒,测定其病毒滴度以及利用荧光定量PCR测定其病毒基因组拷贝数。结果显示,在24至72 hpi,GH株在IFNAR1^-/-vero细胞上的滴度和病毒拷贝数显著高于WT vero细胞组,但在96hpi,GH株在IFNAR1^-/-vero细胞上的滴度和病毒拷贝数比WT vero细胞组低,经过T方差分析,其P值为0.054>0.05,认为其差异不显著。4.本研究成功构建了I型干扰素受体缺失的Vero细胞,PEDV在其上培养增值显著增加,为研发更高效价的PEDV疫苗奠定了基础。