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三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国重要的淡水养殖贝类之一,TGF-β介导的信号通路在胚胎发育、组织和器官的形成、创伤修复及免疫应答调节等方面发挥重要的作用。本研究克隆了三角帆蚌的TGF-β及其I型受体(TGF-βRI)基因的cDNA全长序列。结果表明:三角帆蚌TGF-β基因cDNA序列全长2850bp,其中5’非编码区(UTR)长度为211bp;3’UTR为1457bp;开放阅读框(ORF)为1182bp,编码393个氨基酸。预测的TGF-β蛋白包含1个25aa的信号肽,1个TGF-β结构域(294-393)。TGF-βRI基因的cDNA全长序列为2017bp,其中5’UTR为80bp;3’UTR为383bp;ORF长度为1554bp,编码517个氨基酸。预测的TGF-βRI蛋白包含信号肽(1-22aa),膜外区(23-127aa)、跨膜区(128-150aa)以及胞内区(151-517)。胞内区含有TGF-β受体特征序列GS结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域。序列比对分析显示:三角帆蚌TGF-β与哺乳动物TGF-β1同源性为25%。预测的TGF-β成熟蛋白由18个β折叠片和5个α螺旋组成,与人TGF-β1具有相似的空间结构。TGF-βRI与马氏珠母贝(Pinctada martensii)、斑马鱼(Danio rerio),鼠(Mus musculus)等物种的同源性均为63%。实时定量结果表明:TGF-βRI基因在健康蚌血液、外套膜、肌肉、鳃和肝胰脏中均有表达,其在鳃中表达量最高,血液中表达量最低。嗜水气单胞菌刺激后的3和6h,TGF-βRI在血液中表达量显著性上调(p<0.05);6,12,24 h后,在肝胰脏中表达量显著性上调(p<0.05)。肽聚糖刺激后,TGF-βRI分别在3h的血细胞及24h的肝胰腺中表达上调(p<0.05),48h后恢复至初始水平。在三角帆蚌外套膜创伤修复模型中,创伤后的第1,3,5,10d,TGF-βRI基因表达均显著上调(p<0.05),至第15d恢复至初始水平。将编码TGF-β成熟肽的cDNA序列插入到pET-30a中转化大肠杆菌Top10,筛选重组质粒,然后转入BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导,亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化,采用Bradford法测定重组TGF-β蛋白浓度为0.318 mg/ml。将编码TGF-βRI胞内段cDNA序列插入pET-32a载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami(DE3),IPTG诱导得到的重组蛋白以包涵体形式存在,纯化的重组蛋白浓度为0.5mg/mL。将获得的重组TGF-β和TGF-βRI分别注射入新西兰大白兔体内,制备了多克隆抗体,western blot检测表明获得了高特异性的抗TGF-β和TGF-βRI多克隆抗体。利用多克隆抗体检测TGF-βRI蛋白在三角帆蚌中肝、血、鳃、肌肉、外套膜中的分布及创伤状态下在外套膜组织中的表达情况变化,表明其主要表达于肝胰脏、鳃和肌肉中,创伤后,TGF-βRI随着创伤时间变化表达量增加。抑制剂SB431542处理后,与健康组相比,TGF-β信号通路下游基因Smad3,Smad4,Smad5在大部分时间点均上调,少数时间点下调,而MMP1基因在处理后第3天和第5天显著下调,MMP19基因在第10天显著下调,TIMP1呈下调趋势,但与健康组相比差异不显著,TIMP2在第1天和第3天均显著下调,15d后恢复至创伤组水平。