论文部分内容阅读
在真核细胞内,内吞体分选转运复合体（the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）具有剪切脂质双层膜的功能,参与多泡体的形成、胞质分裂、质膜修复、核膜重构及囊膜病毒的入侵和出芽释放等多种生理代谢过程。已知,ESCRT复合体由ESCRT-0-III和Vps4等五个复合物以及一些辅助蛋白组成。其中ESCRT-0-II主要负责转运物的分选和囊泡的形成,而ESCRT-III则作为“剪刀手”直接参与囊泡的剪切释放。最后,Vps4水解ATP催化ESCRT-III复合物解离。杆状病毒是一类大分子双链DNA囊膜病毒。在感染周期中,杆状病毒通常产生两种类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子（budded virions,BV）和包埋型病毒粒子（occlusion-derived virions,ODV）。近期的研究表明,过表达Vps4的显性-负性突变体（Dominant-negative,DN）显著降低苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染性BV的入侵和出芽释放。然而,关于宿主细胞ESCRT复合体在AcMNPV感染中的作用尚不明确。在本研究中,我们从草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞Sf9中克隆了ESCRT-III关键组成基因Vps2B、Vps20、Vps24、Snf7、Vps46和Vps60。序列分析表明,草地贪夜蛾ESCRT-III各组分的同源基因广泛存在于已测序的昆虫基因组中。激光共聚焦分析表明,表达瞬时转染质粒的细胞中,融合GFP标签的ESCRT-III各组分与融合mCherry标签的Vps4突变体E231Q存在共定位,推测这些融合蛋白可能定位于细胞内吞体中。采用病毒缺失-补偿系统（瞬时转染病毒膜蛋白GP64的表达质粒拯救缺失gp64基因AcMNPV的复制）,我们发现过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分（DN突变体）显著减少进入宿主细胞的病毒粒子,并且进入细胞的病毒粒子大多数被束缚在细胞质中不能被有效转运至细胞核进行复制。进一步利用β-galactosidase与β-glucuronidase作为标记基因并结合定量检测病毒基因组DNA的复制来分析病毒基因的表达,我们发现过表达ESCRT-III组分显性-负性突变体显著抑制病毒复制的早期阶段。揭示宿主ESCRT-III复合物与AcMNPV入侵有关;为了避免表达ESCRT-III各组分的显性-负性突变体对病毒入侵的影响,我们把融合GFP的ESCRT-III各组分构建到AcMNPV基因组DNA（bacmid）中,然后转染Sf9细胞。在转染后24小时,收集细胞上清并分析感染性AcMNPV的产量。结果表明,过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分显著抑制感染性病毒的产量。透射电子显微镜分析表明,表达融合GFP标签的ESCRT-III组分蛋白Vps24与Snf7均能显著抑制子代病毒核衣壳从核膜释放,这些数据揭示ESCRT-III参与感染性AcMNPV出芽型病毒粒子的释放过程。由于AcMNPV出芽型病毒粒子的释放依赖于自身编码的一些蛋白（如Ac93:AcMNPV ORF93编码的蛋白）,我们选择Ac93作为目的蛋白进一步分析病毒蛋白与宿主ESCRT-III亚基及Vps4之间可能的相互作用关系。利用免疫共沉淀和双分子荧光互补分析发现,Ac93与ESCRT-III各组分及Vps4均存在相互作用。而Ac93与Vps4的两个突变体K176Q和E231Q之间存在的相互作用揭示Ac93与Vps4的相互作用并不依赖于其ATP酶活性。进一步分析表明,Ac93与另外两个参与子代核衣壳从核膜释放的病毒蛋白Ac76与Ac103之间存在相互作用。这些数据表明:Ac93可能与Ac76、Ac103、ESCRT-III及Vps4形成复合物参与调控BV的出芽释放过程。为了进一步明确Ac93与ESCRT-III亚基及Vps4的相互作用机制,我们首先对杆状病毒Ac93同源蛋白序列进行比对分析发现在Ac93的C-末端存在一个富含亮氨酸的MIM1-like模序,它可能参与Ac93与ESCRT-III亚基以及Vps4的相互作用。采用定点突变方法,我们构建了一系列由丙氨酸替换6个保守亮氨酸的单点或多点突变体。瞬时表达分析表明,丙氨酸替换亮氨酸不影响Ac93突变体的表达。免疫共沉淀与双分子荧光互补分析发现,丙氨酸替换单个或多个亮氨酸均不同程度降低了Ac93与ESCRT-III各组分、Vps4及病毒蛋白Ac76或Ac103的相互作用。同时,单个或多个位点突变均显著降低了感染性AcMNPV的产量及自带病毒核衣壳经核膜出芽释放效率及病毒诱导的核内微囊泡的形成。Vps4此外,由于AcMNPV的侵染依赖于宿主脂肪酸合成酶活性,为了探讨线粒体在杆状病毒侵染中的作用,我们初步获取了草地贪夜蛾（S.frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）线粒体基因组序列,并进行了初步组装分析。总之,上述研究揭示宿主细胞ESCRT-III/Vps4参与AcMNPV的入侵和出芽释放过程,er而病毒自身编码的关键蛋白Ac93可能通过与病毒蛋白Ac76及Ac103互作形成复合体参与募集ESCRT-III/Vps4进而调控子代BV的出芽释放和ODV的组装。Vps4