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口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的烈性传染性疾病。曾多次在世界范围内爆发,造成严重的经济损失。接种灭活口蹄疫病毒疫苗是预防口蹄疫最有效的手段。随着对疫苗安全性和质量要求的不断提高,对其进行有效的分离纯化日益受到重视。色谱分离具有分辨率高、易于规模放大的优势,在动物疫苗分离纯化中具有潜在的应用前景。但是如何实现结构复杂、尺寸达到28 nm的病毒抗原颗粒在有效分离纯化的同时,保持颗粒结构的稳定,获得高的抗原收率,仍然是一个挑战。本文旨在通过研究灭活FMDV在离子交换色谱分离过程中,影响其分离效率和颗粒稳定性的关键因素,以建立高效的纯化工艺。主要研究内容包括如下几方面:(1)选取DEAE-FF、DEAE-650M、以及DEAE-POROS三种具有相似配基密度和粒径,但孔径显著不同的阴离子交换介质,考察了介质孔径对灭活FMDV动态结合载量(Dynamic binding capacity,DBC)的影响。发现灭活 FMDV 在 DEAE-POROS(孔径214 nm)和DEAE-650M(孔径106 nm)介质上的DBC分别达到11.53和10.03mg/mL,而在小孔径的琼脂糖介质DEAE-FF(孔径32nm)介质上的DBC仅为前两者的1/10。激光共聚焦实验表明灭活FMDV在DEAE-FF介质上的吸附仅限于微球的表面薄层区域,而在大孔DEAE-POROS介质上的吸附能扩散进入微球内部。(2)研究了离子交换介质孔径对灭活FMDV纯化收率和稳定性的影响。经过DEAE-FF、DEAE-650M、以及DEAE-POROS离子交换层析后,灭活FMDV的收率分别为54.46%、66.32%和68.42%。通过高效液相凝胶过滤色谱法(HPSEC)分析发现,灭活FMDV与介质吸附-解吸作用会导致其裂解成无免疫活性的12S,且裂解程度随着介质孔径的增大而减小。利用差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimetry,DSC)分析灭活FDMV吸附在介质上发生解聚的机理。灭活FMDV在溶液中发生裂解生成12S的转变温度Tm1为48.52℃。而吸附在三种介质上之后的Tm1值分别降低为41.73℃,44.04℃和45.37℃,表明在层析介质上的吸附导致灭活FMDV更易于发生裂解,而吸附在大孔径的DEAE-POROS介质上的灭活FMDV的稳定性相对较高。(3)建立了大孔DEAE-POROS介质纯化灭活FMDV的工艺。对缓冲液的电导率、进样蛋白浓度、停留时间等参数进行了优化。优化条件下,灭活FMDV的IEC收率达94%。经过进一步超滤浓缩和凝胶过滤色谱(SEC)精制,最终灭活FMDV收率为79%,纯化倍数为173,宿主DNA的去除率达95%以上。本文研究结果表明大孔介质纯化灭活FMDV相比传统的琼脂糖介质在动态结合载量、活性收率和结构稳定性上具有明显的优势,并探讨了可能的作用机理,对灭活FMDV的色谱纯化具有一定的指导意义。