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弯曲菌,重要的食源性病原菌之一,主要存在于动物的肠道中。通过接触或食用畜禽的肉、蛋、奶等食品后,人们有感染弯曲菌的风险,可导致患病。抗菌药广泛应用,弯曲菌对其产生严重的耐药性。消毒剂是一种可控制微生物污染的有机物质,广泛用于细菌性感染的预防和治疗。密集地使用消毒剂也导致细菌对其产生耐药性,而且在其长期选择压力下,一些潜在敏感细菌的生长、运动、黏附力等发生变化,即出现适应性,且伴随对自身适应性抗性以及对其他消毒剂和抗菌药交叉/共耐药的风险。然而目前关于弯曲菌在消毒剂选择压力下产生的适应性及其诱发对其他消毒剂和抗菌药交叉/共耐药的机制尚不清楚。本课题首先研究了临床弯曲菌对常用抗菌药和消毒剂交叉/共耐药分布以及两者对弯曲菌的消杀能力;然后研究了弯曲菌暴露于逐渐增加浓度消毒剂前后,菌株形态、生长力、对本身消毒剂的适应性抗性、对其他消毒剂和抗菌药的交叉/共耐药以及表型抗性稳定性等变化;随后对适应菌株可能耐药相关机制,如外膜蛋白、外排活性和生物膜形成进行检测,并进行转录组测序分析,旨在探索消毒剂选择压力下,弯曲菌的适应性及其诱发消毒剂和抗菌药交叉/共耐药的机制,为临床合理用药和深入研究消毒剂和抗菌药耐药相关性提供理论和数据支撑。1临床弯曲菌对常用抗菌药和消毒剂交叉/共耐药的分布本研究从临床样品中分离得到66株弯曲菌（31株空肠弯曲菌和35株结肠弯曲菌）,采用微量肉汤稀释法检测了临床菌株对9种抗菌药的敏感性。根据耐药判定标准,临床菌株对庆大霉素（Gentamicin,GEN）的耐药率为57.58%;对克林霉素（Clindamycin,CLI）的耐药率为48.48%;对氟苯尼考（Flufenicol,FFC）的耐药率为9.09%;对四环素（Tetracycline,TET）的耐药率为83.33%;对环丙沙星（Ciprofloxacin,CIP）的耐药率为81.82%;对阿奇霉素（Azithromycin,AZM）的耐药率为53.03%;对红霉素（Erythromycin,ERY）的耐药率为43.94%;对萘啶酸（Naphthalenic acid,NAL）的耐药率为87.88%以及对泰利霉素（Telythromycin,TEL）的耐药率为31.82%,多重耐药率为84.85%。采用同样方法检测了3种消毒剂（镇疫醛（Glutaraland deciquam solution,GDS）、复方戊二醛（Compound glutaral solution,CGS）和百毒杀（Dimethyldidecyl ammonium bromide,DDAB））对菌株的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）,分别以3种消毒剂对临床菌株的MIC90为耐药判定折点（7.81μg/m L（GDS）、3.91μg/m L（CGS）、1.95μg/m L（DDAB））,MIC≥MIC90,判定为耐药,MIC<MIC90,判定为敏感。经分析,临床菌株对GDS、CGS和DDAB的耐药率依次是78.79%,12.12%和31.82%,多重耐药率为10.61%。74.24%临床弯曲菌对抗菌药和消毒剂显示交叉/共耐药,其中对ERY、CIP、TET、AZM、TEL与GDS的交叉/共耐药现象较普遍,其次是与DDAB和CGS,表明临床弯曲菌对抗菌药和消毒剂交叉/共耐药现象较严重。2常用消毒剂和关键抗菌药对弯曲菌消杀作用比较本研究检测了流行病学临界值浓度的3种常用消毒剂（GDS、CGS和DDAB）和4种关键抗菌药（FFC、GEN、ERY和AZM）对弯曲菌（Cj.35、Cj.36、Cj.37、Cj.40、ATCC33560和NCTC11168）分别作用1 min、5 min、10 min、30min和60 min的杀灭率,以比较消毒剂和抗菌药对空肠弯曲菌的消杀作用。研究结果表明对于任一菌株,7种药物在不同时间段内的杀菌速率存在差异,且相比较于4种抗菌药,GDS、CGS和DDAB在短时间内对弯曲菌的消杀作用较强。3消毒剂诱导弯曲菌的适应性和交叉/共耐药研究本研究通过逐渐增加浓度GDS、CGS和DDAB体外诱导试验,得到适应不同消毒剂的菌株。其中适应DDAB的Cj.36、Cj.37和NCTC11168菌株,表现对本身消毒剂适应性抗性、对GDS交叉/共耐药以及对ERY、TET、CIP、AZM等抗菌药敏感性降低且抗性稳定的现象最为显著。与预适应菌株相比,Cj.36-DDAB-1MIC、Cj.37-DDAB-4MIC和NCTC11168-DDAB-2MIC等消毒剂诱导耐药菌株的细菌形态存在拉长,鞭毛丢失、弯曲成球形、外膜起泡和胞质泄露的现象;其外膜蛋白谱显示分子质量约为32 k Da、55 k Da、70 k Da和95k Da的外膜蛋白含量增加和/或减少;在外排泵抑制剂（对氨基苯腈（4-aminobenzonitrile,PAβN）、羰酰氰间氯苯腙（Carbonyl cyanide mchlorophenylhyd-razone,CCCP）、N-甲基吡咯烷酮（N-methylpyrrolidone,NMP）、维拉帕米和利血平）存在时,表现对GDS、CGS和DDAB敏感性增加,丧失适应性抗性和交叉/共耐药;且在24 h、48 h和72 h均有弱/强生物膜形成;表明外膜蛋白改变,外排泵活性和生物膜形成可能参与消毒剂诱导弯曲菌对其他消毒剂和抗菌药的交叉/共耐药。4消毒剂诱导耐药空肠弯曲菌的转录组测序分析本研究对DDAB诱导耐药空肠弯曲菌Cj.36-DDAB-1MIC（B组）、Cj.37-DDAB-4MIC（D组）和NCTC11168-DDAB-2MIC（F组）与其相应亲本菌株Cj.36（A组）、Cj.37（C组）和NCTC11168（E组）进行转录组测序,对差异表达基因（Differential expression genes,DEGs）进行分析。研究结果显示,A vs B组有75个DEGs,28个基因表达量增加,47个基因表达量减少;C vs D组有244个DEGs,131个基因表达量增加,113个基因表达量减少;E vs F组有151个DEGs,85个基因表达量增加,66个基因表达量减少。A vs B组与C vs D组共有25个DEGs,A vs B组与E vs F组共有20个DEGs,C vs D组与E vs F组共有89个DEGs,三组共有11个DEGs。三组中,与外膜蛋白相关DEGs共有6个,分别是bam D、map A、Cj0091、Cj0694、Cj1026c和Cj1721c。与外排泵相关DEGs共有2个,分别是cme A和cme R。与生物膜相关DEGs共有26个,其中fla A,flg D、flg E、pse D、pse E、Cj1324和Cj1325等基因表达量变化较为显著。基因差异表达调控外膜蛋白变化,外排泵活性和生物膜形成。此外,在NCTC11168-DDAB-2MIC适应菌株中发现与ERY抗性相关基因Cj1199表达上调,Cj.36-DDAB-1MIC和Cj.37-DDAB-4MIC适应菌株中与CRISPR-cas适应性免疫系统核糖核酸内切酶cas2家族蛋白相关基因Cj1521c上调表达。综上,在GDS、CGS和DDAB长期选择压力下,空肠弯曲菌除表现对本身消毒剂适应性抗性外,还产生了对其他消毒剂的交叉/共耐药以及对ERY、NAL和CIP等抗菌药的敏感性降低。消毒剂诱导耐药菌株中与外膜蛋白、外排泵和生物膜相关基因差异表达,证明外膜蛋白变化,外排泵活性和生物膜形成是消毒剂诱导空肠弯曲菌对其他消毒剂和抗菌药交叉/共耐药机制。此外,ERY抗性基因Cj1199和CRISPR-cas适应性免疫系统相关基因Cj1521c上调表达,也可能参与交叉/共耐药的形成,需后期深入研究。本研究分析了临床弯曲菌对抗菌药和消毒剂的交叉/共耐药,也对消毒剂体外诱导弯曲菌的交叉/共耐药分子机制进行了分析,对临床合理用药以及深入研究消毒剂和抗菌药耐药相关性具有深远意义。