【摘 要】
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提升猪的分子育种技术与种质创新能力,是我国养猪业迫切需要解决的关键问题。产仔数是猪繁殖效率最直观的度量指标,在猪的遗传改良中占有非常重要的地位。胚胎死亡率是限制母猪产仔潜能的关键因素,30%的胚胎死亡发生在猪胚胎附植阶段,因此对猪胚胎附植调控机制的研究将有助于解析猪产仔数遗传基础。蛋白质糖基化修饰是比较常见的翻译后修饰,但由于聚糖结构的多样性,目前对蛋白质糖基化修饰在猪胚胎附植中的作用鲜有报道。唾
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提升猪的分子育种技术与种质创新能力,是我国养猪业迫切需要解决的关键问题。产仔数是猪繁殖效率最直观的度量指标,在猪的遗传改良中占有非常重要的地位。胚胎死亡率是限制母猪产仔潜能的关键因素,30%的胚胎死亡发生在猪胚胎附植阶段,因此对猪胚胎附植调控机制的研究将有助于解析猪产仔数遗传基础。蛋白质糖基化修饰是比较常见的翻译后修饰,但由于聚糖结构的多样性,目前对蛋白质糖基化修饰在猪胚胎附植中的作用鲜有报道。唾液酸是一种九碳单糖,常位于聚糖结构末端形成蛋白质的唾液酸化修饰。在本课题组前期的研究中发现:（1）α2,6-唾液酸结构在猪胚胎附植期子宫内膜上皮细胞中表达,且表达模式在胚胎附植前后存在差异,仅在胚胎附植期（妊娠15天）子宫腔上皮表达。（2）α2,6-唾液酸转移酶基因ST6GAL1是介导子宫内膜上皮细胞中蛋白质发生α2,6-唾液酸化修饰的关键基因。因此,本研究首先检测到胚胎附植期（妊娠15天）的猪子宫内膜上皮细胞具有增殖能力,与课题组前期研究发现的ST6GAL1和α2,6-唾液酸结构在猪子宫内膜中的表达模式一致,在此基础上研究了ST6GAL1介导的α2,6-唾液酸化修饰对子宫内膜上皮细胞增殖的调控作用。主要结果如下:1.猪胚胎附植子宫内膜上皮细胞具有增殖特征。本研究对猪妊娠早期的子宫内膜组织进行免疫荧光染色,发现细胞增殖标记蛋白KI67在猪妊娠15天子宫内膜高表达而在12天只有零星表达;同时细胞-基质黏附标记蛋白Integrin-β1在妊娠12天高表达但在妊娠15天子宫内膜低表达,表明胚胎附植期（妊娠15天）的猪子宫内膜上皮细胞具有增殖能力。2.α2,6-唾液酸结构参与调控细胞的增殖。在Ishikawa细胞中利用SNA凝集素对细胞表面的α2,6-唾液酸结构进行覆盖,然后对覆盖前后的细胞增殖情况进行检测。结果表明α2,6-唾液酸结构的存在会促进细胞的增殖。3.ST6GAL1介导形成的α2,6-唾液酸结构会促进细胞的增殖。（1）利用RNA干扰技术进行细胞增殖能力的检测,发现抑制ST6GAL1基因的表达后,细胞的增殖能力极显著降低（P<0.01）;（2）利用流式细胞术对转染siRNA/NC的Ishikawa细胞进行细胞周期检测,结果表明抑制ST6GAL1基因的表达后,Ishikawa细胞发生细胞周期的G1期阻滞;（3）利用Hoechst染色对转染siRNA/NC的Ishikawa细胞进行细胞凋亡分析,发现抑制ST6GAL1基因后Ishikawa细胞表现出细胞凋亡的特征（细胞核浓染及核碎裂）,说明抑制ST6GAL1基因的表达会促进Ishikawa细胞的凋亡。4.ST6GAL1基因介导的α2,6-唾液酸化修饰的GRP78通过调控细胞内质网应激通路影响细胞的增殖。（1）对siRNA/NC干扰后的Ishikawa细胞进行SNA凝集素免疫沉淀,对获得的蛋白质进行LC-MS/MS蛋白质组测序分析。siRNA/NC转染细胞后鉴定出α2,6-唾液酸修饰蛋白分别有177种和152种,其中30%的蛋白质与内质网应激有关。（2）对SNA凝集素沉淀获得的蛋白质进行western blot实验分析发现内质网应激标记蛋白GRP78发生α2,6-唾液酸修饰。进一步对其下游调控蛋白进行western blot分析发现GRP78经α2,6-唾液酸化修饰后通过激活PERK通路影响细胞的增殖。综上所述,本研究发现ST6GAL1基因可能通过介导GRP78的α2,6-唾液酸化修饰调控内质网应激通路影响子宫内膜上皮细胞的增殖。
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