脑卒中(Stroke)在全球的发病率正在逐年攀升,严重危害人体健康,带来沉重的社会经济负担,在这其中约80%以上为缺血性脑卒中。尽管超早期血管再通治疗取得进展,大部分脑梗死患者仍遗留神经功能障碍,给社会家庭造成巨大的经济和精神负担。脑梗死患者病后肢体运动功能障碍有一定程度恢复,说明其恢复期损伤的皮质脊髓束(corticospinal tract,CST)、血管存在再生和重塑,改善这种再生及可塑性将促进神经功能的恢复。经皮迷走神经电刺激(transcutaneous auricular vagus nerve stimulation,ta-VNS)可通过激活乙酰胆碱受体亚基α7(a7nAchR,α7 nicotinic acetylcholine receptor)影响胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)的活动,我们前期研究发现在脑梗死恢复期持续给与ta-VNS治疗可促进脑梗死缺损神经功能的恢复,不能以单纯的拮抗炎症反应来解释,推测CAP活动调控轴突可塑性、血管新生从而促进运动功能的恢复。本研究采用大鼠MCAO/R模型,从整体动物水平研究验证脑梗死后恢复期调控CAP对CST可塑性、血管新生和前肢运动功能恢复的影响,探讨PPAR-γ信号通路活动在其中的作用。并应用ta-VNS作为临床脑梗死患者的辅助治疗方式以观察其疗效,从而为脑梗死患者恢复期补充治疗方式的研究提供理论依据。第一部分脑梗死后恢复期CAP中的关键受体a7nAchR在脑缺血/再灌注损伤大鼠模型中的时空表达及经皮迷走神经电刺激对其的影响目的:主要观察大鼠脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤后脑组织a7nAchR的表达定位及经皮迷走神经电刺激(transcutaneous auricular vagus nerve stimulation,ta-VNS)对其的影响,探讨脑梗死后中枢神经系统胆碱能抗炎通路(CAP)活动的自发变化,ta-VNS在脑梗死后恢复期是否可促进CAP的活动。方法:1.采用线栓法制作Sprague-Dawley(SD)大鼠右侧大脑中动脉缺血/再灌注(middle cerebral occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型并辅以ta-VNS治疗。2.使用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)、荧光定量PCR和免疫组化的研究方法测量a7nAchR在MCAO/R建模及ta-VNS干预后14d和28d的表达变化。3.运用免疫组织荧光双标技术检测MCAO/R损伤后皮层a7nAchR的组织细胞定位情况。结果:1.对于SD大鼠造模成功的标准,采用激光多普勒血流仪根据梗阻前30分钟脑血流量较基础值下降百分之70到80并且在再灌注恢复期前10分钟脑血流恢复到基础值的百分之70以上视为大鼠MCAO/R造模成功,将这些成功模型纳入组。2.SD大鼠MCAO/R损伤后14d损伤侧缺血皮层a7nAchR的表达较假手术组(sham group)明显升高(p<0.05),到28天又重新恢复正常水平(p>0.05),经过ta-VNS干预后a7nAchR的表达在两个时间点较I/R组显著提升(p<0.05)。3.在损伤同侧皮层a7nAchR与神经元标志物(NeuN)阳性细胞共表达,且与星形胶质细胞标志物(GFAP)阳性细胞共定位。结论:1.SD大鼠MCAO/R损伤后的缺血同侧皮层中,a7nAchR的表达在14d升高,28d又恢复正常,且主要表达在神经元和星型胶质细胞中。提示其在脑I/R损伤后的病理生理过程中可能发挥重要作用。2.ta-VNS干预可以上调大鼠脑I/R损伤后a7nAchR的表达继而激活CAP,提示中枢性CAP活动的激活可能和ta-VNS治疗在脑梗死恢复期的神经保护作用密切相关。第二部分调控中枢性CAP活动的关键受体a7nAchR对MCAO/R模型大鼠轴突可塑性、血管新生的作用以及运动功能恢复的影响目的:为了明确调控CAP活动在脑I/R损伤后的作用,我们将评估CAP对脑I/R损伤所致的神经运动功能障碍的影响。根据最近的研究报道,我们推测调控CAP的活动变化对神经功能的影响可能与其调节轴突可塑性及血管新生密切相关。在此部分研究中,我们将着重研究CAP在脑梗死恢复期对脑I/R损伤后轴突可塑性及血管新生的调节作用。方法:1.购买a7nAchR的拮抗剂,然后将以PBS稀释配置好的液体以6mg/kg的比例腹腔注射入SD大鼠体内从而干预a7nAchR的功能,通过WB来检测a7nAchR拮抗剂的干预效率。2.采用改良神经功能严重程度评分量表(modified neurological severity score,mNSS)和脱胶体感测试(adhesive-removal somatosensory test,ARST)试验来评判神经功能改变。3.采取免疫荧光双标技术分别测量a7nAchR与Nestin(神经干细胞标志物)、DCX(未成熟神经元标志物)共定位关系,从而揭示大脑I/R损伤后调节CAP对神经生发的作用。4.检测使用拮抗剂干预a7nAchR功能后轴突生长相关蛋白43(growth associated protein-43,GAP43)和神经丝蛋白200(neurofilament-200,NF-200)的表达变化,以揭示大脑I/R损伤后调节CAP对轴突生长的作用。5.在大鼠脑I/R损伤对侧的运动感觉皮层区域用微量注射器立体定位注射生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA),神经纤维示踪跨胼胝体中线的轴突出芽以及皮质红核束新生跨中线的神经纤维,以揭示脑I/R损伤后调控CAP对轴突再生重排的作用。6.使用内皮细胞标志物CD31通过免疫荧光染色从而反应脑I/R损伤后调控CAP对血管新生的作用。7.使用WB技术检测各组BDNF及VEGF的表达情况,以反映脑I/R损伤后调控CAP对轴突可塑性及血管新生的分子基础。结果:1.WB实验结果显示,使用a7nAchR拮抗剂能够明显降低a7nAchR的表达水平(p<0.05)。2.mNSS和ARST两项神经功能评估均提示,脑缺血再灌注后14d和28d,神经功能较sham组出现明显缺失(p<0.05)。ta-VNS治疗可以显著激活CAP从而促进神经功能恢复(p<0.05),而利用a7nAchR拮抗剂阻断a7nAchR功能后,ta-VNS治疗对模型大鼠神经功能的改善作用消失。3.免疫荧光双标结果提示,大鼠脑I/R损伤后,在损伤同侧梗死周围皮质a7nAchR分别与Nestin、DCX都有共表达。4.WB检测结果显示,大鼠脑I/R后28d激活CAP(ta-VNS)可明显促进GAP43的表达(p<0.05),然而拮抗a7nAchR功能后则可以明显抑制ta-VNS治疗对GAP43表达的促进作用(p<0.05)。免疫组化结果提示,脑I/R损伤后,NF200阳性纤维较sham组明显变少、变短,且排列紊乱(p<0.05);ta-VNS治疗28d后,缺血侧皮质区NF200阳性纤维损伤显著减少,而使用a7nAchR拮抗剂后,ta-VNS治疗对神经纤维的保护作用消失(p<0.05)。5.BDA神经示踪显示,激活CAP(ta-VNS)可明显促进跨胼胝体中线的轴突出芽和皮质红核束新生跨中线的神经纤维数量(p<0.05);使用a7nAchR拮抗剂则可以显著显著消除ta-VNS治疗对轴突重排的促进作用(p<0.05)。6.免疫荧光结果提示较sham组,缺血组大鼠模型有部分血管新生(p<0.05),激活CAP(ta-VNS)后血管新生情况较I/R组显著提升(p<0.05),而使用a7nAchR拮抗剂后ta-VNS治疗对血管新生的促进作用则消失(p<0.05)。7.WB结果提示较sham组,I/R组大鼠的BDNF及VEGF的分子表达在28d仍有显著性差异(p<0.05),激活CAP(ta-VNS)后BDNF、VEGF的表达较缺血组进一步提升(p<0.05),而当使用a7nAchR拮抗剂后ta-VNS治疗对BDNF及VEGF分子的促进作用消失(p<0.05)。结论:1.脑缺血本身可触发一定程度的轴突再生重排和血管新生,这是脑缺血后神经功能障碍得以一定恢复的解剖基础;2.CAP的调节保护作用可能与脑I/R损伤后的轴突可塑性及血管新生有密切关系,它的激活可以促进损伤后的轴突可塑性和血管再生。CAP的激活(ta-VNS)可能通过上调BDNF及VEGF生长因子的表达从而促进脑I/R损伤后的轴突可塑性和血管新生,从而改善脑梗死后慢性期的神经运动功能的恢复。第三部分激活CAP通过上调PPAR-γ进而促进脑I/R损伤后脑的轴突可塑性及血管新生目的:PPAR-γ作为重要的核转录因子,在体内发挥重要而丰富的作用,我们之前的研究发现迷走神经电刺激可以上调PPAR-γ的表达,近来来文献报道指出,PPAR-γ可以调节BDNF和VEGF等生长因子的表达和分泌,基于此,我们推断ta-VNS可通过激活CAP进而激活其下游PPAR-γ核转录因子从而促进BDNF及VEGF的表达分泌,继而发挥调节脑I/R损伤后轴突可塑性及血管再生的作用,最终改善神经运动功能的恢复。在此部分研究中,我们将重点探讨PPAR-γ作为CAP下游的重要分子对脑I/R损伤后轴突可塑性和血管再生的调节作用。方法:1.使用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)、荧光定量PCR和免疫荧光的研究方法测量PPAR-γ在MCAO/R建模及ta-VNS治疗后14d和28d的表达变化以及PPAR-γ的组织细胞定位。2.运用wb、荧光定量PCR技术检测MCAO/R模型大鼠激活及拮抗CAP活动后对PPAR-γ表达的影响。3.构建携带PPAR-γ-RNAi片段的慢病毒(Lentivirus,LV),然后用微量注射器把LV-siPPAR-γ立体定位注射至损伤同侧感觉运动区皮层,抑制PPAR-γ的表达,于建模后28d通过WB检测病毒注射区脑组织中PPAR-γ表达水平,从而验证慢病毒的干预效率。4.建模两周前我们将LV-siPPAR-γ立体定位注射至损伤同侧运动感觉皮层区,抑制PPAR-γ的表达,大鼠行MCAO术后30min,我们使用经皮迷走神经电刺激进行治疗,于建模后28d通过免疫组化技术检测各组大鼠脑组织中GAP43及NF-200的表达情况。从而反映脑I/R损伤后PPAR-γ作为CAP的下游分子对轴突可塑性的调控作用。5.使用内皮细胞标志物CD31及细胞增殖标志物Ki67通过免疫荧光染色从而反应脑I/R损伤后PPAR-γ作为CAP的下游分子对血管新生的调控效应。6.使用WB、荧光定量PCR技术检测ta-VNS治疗联合抑制PPAR-γ表达对MCAO/R模型大鼠各组BDNF、VEGF分子表达的调节。结果:1.SD大鼠MCAO/R损伤后14d损伤侧缺血皮层PPAR-γ的表达较假手术组(sham group)明显升高(p<0.05),到28天又重新恢复正常水平(p>0.05),经过ta-VNS治疗后PPAR-γ的表达在两个时间点较I/R组显著提升(p<0.05)。在损伤侧皮层PPAR-γ与神经元标志物(NeuN)且与星形胶质细胞标志物(GFAP)阳性细胞共表达。2.WB及荧光定量PCR技术检测结果提示,缺血14d、28d激活CAP(ta-VNS)可明显促进PPAR-γ的表达(p<0.05),然而拮抗a7nAchR功能后则可以明显抑制ta-VNS对PPAR-γ表达的促进作用(p<0.05)。3.WB检测结果提示,LV-siPPAR-γ可有效敲减PPAR-γ的表达。4.免疫组化结果显示,脑I/R损伤后28d通过激活CAP(ta-VNS)可明显促进GAP43的表达(p<0.05),然而用相应LV抑制PPAR-γ的表达后则可以明显抑制ta-VNS干预对GAP43表达的促进作用(p<0.05)。免疫组化结果提示,脑I/R损伤后,NF200阳性纤维较sham组明显变少、变短,且排列紊乱(p<0.05);ta-VNS干预治疗28d后,NF200阳性纤维损伤显著减少,而使用LV抑制PPAR-γ的表达后,ta-VNS治疗对神经纤维的保护作用消失(p<0.05)。5.免疫荧光结果提示较正常组,缺血组大鼠模型在28d有部分血管新生(p<0.05),激活CAP(ta-VNS)后血管新生情况较缺血组显著提升(p<0.05),而使用LV抑制PPAR-γ的表达后,ta-VNS干预对血管新生的促进作用则消失(p<0.05)。6.WB结果提示较sham组,SD大鼠的BDNF及VEGF分子表达在I/R后28d仍有显著增加(p<0.05),激活CAP(ta-VNS)后BDNF、VEGF较缺血组进一步提升(p<0.05),而当使用相应LV抑制PPAR-γ的表达后,ta-VNS干预对BDNF及VEGF分子表达的促进作用则消失(p<0.05)。结论:大鼠脑I/R损伤后,CAP的激活可以通过调节其下游PPAR-γ的活动继而影响BDNF和VEGF分子的表达分泌,从而有效促进轴突的可塑性与血管新生。第四部分经皮迷走神经电刺激治疗可以改善临床脑卒中患者的神经功能康复目的:探讨经耳迷走神经电刺激对脑脑梗死患者神经功能恢复的影响。方法:2018年4月至2019年4月,符合入组标准的初发脑梗死患者随机分成常规治疗组(n=40)和迷走神经电刺激组(n=40),两组患者均进行常规康复训练及基础药物治疗,迷走神经电刺激组患者接受为期28d的耳迷走神经电刺激治疗,常规治疗组则无能量输出。治疗前后采用Fugl-Meyer运动功能评定量表(FMA)及功能独立性评定量表(FIM)进行相关功能的评定。结果:两组患者性别、年龄、病程及NIHSS评分等无显著性差异;与常规治疗组比较,迷走神经电刺激组对运动FMA评分及独立功能FIM评分的改善情况,均明显优于常规治疗组(P<0.05)。结论:经皮迷走神经电刺激可以有效改善脑卒中患者的神经功能康复。