论文部分内容阅读
TNF-α不仅具有抗肿瘤活性，越来越多的研究发现其同样也能够促进肿瘤进展。乳腺癌是目前世界上女性最高发的恶性肿瘤，临床研究发现TNF-α在乳腺癌组织中表达升高，且与肿瘤的侵袭行为及预后相关。大量临床前研究也证实TNF-α在促进乳腺肿瘤进展中扮演着重要作用。长期以来乳腺肿瘤组织中浸润的巨噬细胞被认为是TNF-α的主要来源，介导炎症过程对肿瘤进展的促进作用，但也有数项研究在乳腺癌标本中发现TNF-α阳性着染主要位于恶性上皮细胞胞浆内，间质成分着染可忽略不计。显然在现有的研究中乳腺肿瘤中TNF-α的来源存在矛盾和争议，尚无定论。我们及他人的研究均提示MDA-MB-231细胞高表达TNF-α，本实验将其作为研究对象，利用RNAi干扰技术建立稳定下调内源性TNF-α基因表达的单克隆细胞模型，并观察其对MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的影响，以及对乳腺癌临床一线化疗药物多西他赛敏感性的改变，为丰富现有的关于TNF-α在癌症发生中复杂作用的知识，阐明其潜在的作用机制，改进基于调节体内TNF-α的癌症治疗措施提供有价值的信息。第一部分RNAi干扰内源性TNF-α表达的MDA-MB-231稳转细胞株的建立及鉴定主要试验结果如下：1. MDA-MB-231细胞基础tm-TNF-α表达：利用本实验室自制的针对tmTNF-α的鼠单克隆抗体进行流式细胞术间接标记法检测其tmTNF-α表达阳性率为61.6%，验证tmTNF-α在MDA-MB-231中高表达。2. TNF-α shRNA质粒的转化，提取及测序鉴定：将Origene公司设计合成的特异性干扰内源性TNF-α表达的shRNA质粒及对应空载质粒（p GFP-V-RS）转化入DH5α菌株中，保种并提取质粒,送测序，验证目的片段序列存在质粒中，序列准确无误。3. TNF-α shRNA质粒在MDA-MB-231细胞的瞬时转染效率：将TNF-α shRNA质粒及对应的空载体质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞，流式检测GFP阳性率大于80%，提示转然成功。4.荧光显微镜监测稳转单克隆细胞GFP表达：荧光显微镜观察并标记GFP阳性单克隆细胞株，在扩大培养中监测目的质粒处于稳定表达状态。5.：稳转细胞系建立过程中共获得三株稳定表达目的TNF-α shRNA质粒和两株稳定转染空载体质粒的的MDA-MB-231细胞株。将所得单克隆细胞株行流式检测，所有细胞株GFP阳性率均大于99%，提示稳定转染单克隆细胞株筛选成功。6.稳定转染TNF-α shRNA质粒对MDA-MB-231细胞中tmTNF-α蛋白表达的影响：Western blot检测MDA-MB-231shTNF-α细胞A,B,C三株克隆中tmTNF-α表达，均较对照组明显下降，以克隆C最为明显，提示目的质粒成功下调细胞内TNF-α表达。7.稳定转染TNF-α shRNA质粒对MDA-MB-231细胞中tmTNF-αmRNA表达的影响：Realtime PCR检测MDA-MB-231shTNF-α细胞株TNF-α基因转录水平较正常对照细胞下调了70%，进一步验证了稳定转染TNF-α shRNA质粒下调MDA-MB-231细胞中TNF-α mRNA转录第二部分体外研究稳定下调TNF-α对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为及多西紫杉醇敏感性的影响主要试验结果如下：1.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞生长的影响：活细胞计数法和CCK8细胞增殖实验均发现MDA-MB-231shTNF-α生长明显降低，克隆形成能力亦明显低于MDA-MB-231Vector及正常对照MDA-MB-231细胞，提示内源性TNF-α基因的表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。2.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞周期分布的影响：shTNF-α组G0/G1期细胞显著高于MDA-MB-231Vector组和正常对照组；S期细胞所占百分比则明显降低，提示稳定下调TNF-α表达造成MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞。3.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响：划痕法测定MDA-MB-231shTNF-α组迁移距离仅为正常对照组的43%，明显低于MDA-MB-231组及MDA-MB-231Vector组,提示稳定下调TNF-α降低MDA-MB-231细胞迁移能力。4.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响：MDA-MB-231shTNF-α组迁移细胞数目明显低于MDA-MB-231组及MDA-MB-231Vector组细胞，提示稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞侵袭能力具有明显的抑制效应。5.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞软琼脂集落生成生长的影响：shTNF-α组细胞在软琼脂胶中细胞集落数目和大小均明显低于MDA-MB-231组及MDA-MB-231Vector组细胞，稳定下调TNF-α明显抑制MDA-MB-231细胞锚着非依赖生长。6.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞多西紫杉醇敏感性的影响：与亲本细胞MDA-MB-231和Vector细胞相比，稳定下调TNF-α的MDA-MB-231细胞在所设的各多西紫杉醇梯度浓度作用下活性明显降低，稳定下调TNF-α可以提高MDA-MB-231细胞对多西紫杉醇的敏感性。7.稳定下调TNF-α对MDA-MB-231细胞内NF-κB活化的影响：MDA-MB-231shTNF-α细胞内IκB基础含量明显高于MDA-MB-231和MDA-MB-231Vector细胞，对应磷酸化p65含量明显降低，提示NF-κB组成性活化降低。8. WB法检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1：稳定下调TNF-α的MDA-MB-231shTNF-α细胞内，Cyclin D1表达水平明显降低，提示稳定下调TNF-α通过下调Cyclin D1表达阻滞MDA-MB-231细胞于G0/G1期。综上所述，我们发现下调TNF-α显著降低了MDA-MB-231细胞的增殖、转化及运动侵袭能力，造成细胞G0/G1期阻滞，同时明显提高其对乳腺癌临床一线化疗药物多西紫杉醇的敏感性。这些体外研究的结果强烈支持内源性TNF-α在乳腺癌生长和转移中发挥着重要作用。