脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）所致的完全性截瘫，至今尚无有效的治疗办法。SCI的修复和治疗研究，已经进行了半个多世纪，目前仍然是一个难以解决的世界性难题。研究表明：SCI后的功能恢复关键在于中枢神经再生。而中枢神经再生依赖于两个条件，即有存活的、具有生长潜能的神经元和能促进神经纤维再生的适宜微环境。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的发现为SCI的修复和治疗研究带来了新的希望。与其它干细胞一样，NSCs具有分裂增殖和自我更新能力，在适宜条件下或给予适当的信号能够分化为各种神经细胞。NSCs的自身特点决定了它可以作为神经移植材料的理想来源和基因治疗的理想载体。与较早使用的成纤维细胞、雪旺氏细胞以及目前的另一研究热点--嗅球鞘细胞等其它替代材料相比，移植到损伤局部的NSCs不仅可以起到支架作用，还可以分化为神经元参与补充丢失的神经细胞，分化为少突胶质细胞使再生或脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。必要时可进行移植前预分化或调整宿主微环境。如果与基因疗法相结合，把NSCs作为基因治疗的载体细胞，替代的同时表达和分泌特定的目的基因产物，如神经营养因子或轴突生长抑制因子抗体等，就可以提供一种合适的微环境，刺激轴突生长。NSCs的研究为SCI修复和治疗带来诱人的应用前景，而进行这些研究的前提和基础是NSCs的培养。为此本实验第一部分进行了胎鼠NSCs的分离培养，在证实其自我更新能力和多分化潜能的同时检测NSCs特异的Nestin表达以证明本实验分离得到了胎鼠NSCs。由于人和啮齿动物之间存在较大的种属差异，不可能将啮齿动物NSCs最终用于临床实验研究，因此借鉴培养胎鼠NSCs的经验，本实验第二部分进行了人胚NSCs的分离培养，并证实其具有自我更新能力和多分化潜能，依据干细胞的定性标准证明本实验从人胚神经组织分离的细胞群为NSCs。以期为NSCs的体内实验以及移植修复SCI的实验研究奠定基础。第一部分 胎鼠神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从孕14～16天的胎鼠脑皮质分离细胞，接种于含有bFGF的无血清培养基培养并连续传代，通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状态；利用透射电镜了解NSCs的超微结构和神经细胞球（neurosphere）的内部结构；采用免疫荧光细胞化学技术、RT-PCR和基因测序法共同检测NSCs标志物Nestin的表达；综合应用单细胞克隆实验、BrdU标记法、流式细胞仪和MTT比色法检测细胞的增殖情况及bFGF对其增殖能力的影<WP=9>响，推测bFGF的作用机制；诱导NSCs分化以证实其多向潜能性，同时设置对照组观察血清对分化表型的影响。实验结果显示：培养细胞以悬浮细胞球的形式生长，单个细胞的超微结构呈现典型的低分化特点，可见不对称分裂细胞，在细胞球内部，除少量凋亡样细胞外，相互间的细胞结构无显著区别；免疫荧光染色观察到细胞球内大量Nestin抗原阳性细胞，RT-PCR检测和基因测序更加确凿无疑地证明这些细胞表达Nestin；细胞克隆分析明确证实单个细胞可分裂增殖形成克隆细胞球；BrdU标记观测到细胞球中含有很多S期细胞及分裂增殖产生的新生细胞；流式细胞仪测定结果显示细胞传代后S期细胞比例及增殖指数（PI）增高；MTT比色法检测结果表明培养细胞具有很强的分裂增殖能力，添加bFGF的实验组干细胞增殖能力显著增强，与对照组相比具有显著差异（P<0.01）；这些细胞经诱导分化可生成中枢神经系统（central nervous svstem，CNS）中所有三种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；血清诱导分化产生的GFAP阳性细胞以类原浆性星形胶质细胞为主，而无血清诱导分化则以类纤维性星形胶质细胞为主。培养细胞经多次传代仍保持多潜能性。实验结果表明：本实验培养得到的细胞能够自我更新，具有多向分化潜能，并表达Nestin产物，证明就是NSCs；这些细胞具有很强的分裂增殖能力，单独使用bFGF即可在体外培养扩增，单个细胞具有形成克隆细胞球的能力；bFGF能够通过改变细胞周期促进NSCs分裂增殖；与对照组相比，血清可促进NSCs分化并影响分化细胞的表型，其机理还有待进一步研究。第二部分 人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从流产的12周龄新鲜人胚胎脑皮质取材，机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养技术，添加B27，首次协同应用bFGF、EGF和LIF培养原代细胞，然后由N2添加剂取代B27，结合bFGF和LIF维持细胞的生长增殖及传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状况；利用BrdU标记法检测细胞的增殖能力；胎牛血清诱导分化检测细胞的多分化潜能。实验结果显示：原代细胞接种2-3天后，开始形成球形细胞团，并逐渐增多、增大，培养一周余即得到许多悬浮生长的细胞球；这些细胞具有一定的分裂增殖能力，传代后可继续生长形成新的细胞球；与胎鼠脑皮质NSCs相比，这些细胞增殖速度较慢；BrdU标记结果显示，部分细胞呈BrdU抗原阳性；血清诱导分化可生成CNS中所有三种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。实验结果表明：12周龄人胚脑皮质含有多潜能的NSCs；本实验协同应用bFGF、EGF和LIF原代培养得到的细胞在bFGF和LIF的协同作用下可连续传代，仍保持其多潜能性；这些