[目的]早期妊娠诊断在绵羊的繁殖方面是重要环节之一。当前,随着大多数养殖场逐渐向规模化的方向发展,对妊娠绵羊的鉴定时间有了更高的要求。多年以来,学者们一直在寻求最快的鉴定方法。研究表明,早孕因子是迄今为止最早确定的妊娠指标,而鉴于以往关于早孕因子的研究报道,血液是早孕因子的检测途径之一。在早孕期间,孕酮会抑制黄体溶解,干扰素(IFN)会通过JAK-STAT通路诱导产生对早期胚胎有一定作用的刺激因子。本试验的目的是根据IFNτ诱导的JAK2-STAT1通路及孕酮对早期妊娠母体的相关作用机制,从配种不同时期的绵羊血液中筛选出早孕因子,并对比各个时期早孕因子及其相关妊娠激素含量变化的差异性,从而找到可尽早做出妊娠诊断的相关因子及最佳临床诊断时间。[方法]本试验使用氯前列醇钠,将初产母羊80只同期发情。注射48-72小时后进行试情工作,再从中随机选取30只发情时间相同的母羊进行配种。配种当天记为配种0天。配种后的14-17天进行试情。经试情后发现有6只返情羊,其余的24只母羊则为妊娠母羊。将此24只妊娠母羊分为第Ⅰ组和第Ⅱ组,第Ⅰ组作为返情母羊的对照组,羊只数量应与返情母羊数量一致,因此第Ⅰ组为未返情母羊6只,则第Ⅱ组母羊的数量为剩余的18只。第Ⅲ组为6只返情母羊。第Ⅰ组与第Ⅲ组共计12只母羊用于孕酮、IFNτ、基因的测定。第Ⅱ组共计18只未返情母羊用于蛋白的测定。试验一:取配种后0d,5d,15d,20d,25d的健康母羊的新鲜血液,分离血清,采用ELISA法检测孕酮、IFNτ的含量。试验二:取配种后0d,5d,15d,20d,25d的健康母羊的新鲜血液,提取血液中的单个核细胞,采用荧光定量(qRT--PCR)法初步筛选出血液中的早孕因子Cox1、Cox2、Isg15、Oas1、Mx1、Mx2,并检测相关基因的表达量。试验三:取配种后5d,10d,13d,16d,25d的健康母羊的新鲜血液,提取血液中的总蛋白,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测血液中相关早孕因子蛋白的表达量。[结果](1)未返情与返情两组的血液中孕酮与IFN的含量在配种后0-15天显著下降;两组的孕酮含量在配种后15-25天虽又呈现下降趋势,但未返情组依然保持在较高水平;未返情组IFN的含量在配种后15-25天显著升高,而返情组含量在配种后15-25天下降。(2)IFN通过激活JAK2-STAT1信号通路,使IFN刺激基因Isg15、Oas1、Mx1的mRNA在配种后0-15天表达量下降,配种后15-25天表达量升高;Isg15、Oas1、Mx1的mRNA在配种后0-10表达量下降,配种后10-25天表达量升高;Isg15、Oas1、Mx1的蛋白表达量在配种后13天的表达量最高。(3)比较各基因的未返情与返情两组间的差异性可知,Isg15因子在配种后10天差异性极显著,Oas1因子在配种后10天差异性显著,Cox1与Mx1因子在配种后15天差异性极显著,Mx2因子在配种后20天差异极显著,而Cox2因子在早期妊娠阶段无组间差异性。[结论](1)孕酮可以维持母体的妊娠状态、降低前列腺素的含量。环氧化酶是前列腺素的限速酶,孕酮对环氧化酶-2有拮抗作用,但对环氧化酶-1无明显的作用。(2)IFN通过对JAK2-STAT1信号通路的正调控作用以诱导IFN刺激基因Isg15、Oas1、Mx1的表达。(3)通过分析比较,由于Isg15基因在配种10以后即可出现组间差异,且配种15天后两组变化趋势相反。Isg15蛋白在配种13天表达量最高,且与配种10、16天表达量差异极显著。因此Isg15在妊娠13天可作为早孕诊断的指标。