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猪繁殖与呼吸障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）感染引起的高度接触性传染病,给我国养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV具有复杂的感染及免疫逃逸机制,目前主要靠疫苗接种进行控制,但灭活疫苗的免疫效果不佳,弱毒活疫苗有毒力返强和病毒扩散风险,因此迫切需要防治PRRS的新策略。病毒可溶性受体（Virus soluble receptor,VSR）能与细胞受体竞争结合病毒,从而发挥类似于中和抗体的作用。PRRSV感染猪巨噬细胞的特异受体主要有唾液酸黏附素（Sn）和CD163,Sn前4个Ig样结构域（Sn4D）和CD163第5-9个半胱氨酸富含结构域（SRCR59）含有PRRSV结合部位。在前期研究中,本课题组分别构建了表达Sn4D-Fc和SRCR59-Fc的重组腺病毒载体,其转导细胞能有效抵抗PRRSV感染,但在猪体内的表达时间较短。本研究通过融合表达方式、表达启动子和病毒载体的优化以及Fc片段氨基酸的定点突变,旨在提高PRRSV可溶性受体的体内表达水平和时间。1.重组腺联病毒介导的可溶性受体的融合表达与抗PRRSV活性研究为了提高病毒可溶性受体防治PRRS的实用性,分别将腺联病毒（AAV,adeno-associated virus）Rep基因和Cap基因克隆入杆状病毒载体,获得了重组杆状病毒载体pBac-RC;将AAV末端重复序列（ITR）克隆入杆状病毒载体,获得了杆状病毒转移载体pBac-ITR;分别用GS弹性接头和P2A自切割肽将Sn4D或Sn4D-Fc与SRCR59-Fc相融合,插入pBac-ITR载体后获得了杆状病毒重组载体pBac-Sn4D-SRCR59-Fc 和 pBac-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc,与 pBac-RC 共转染昆虫细胞后获得了 rAAV-Sn4D-SRCR59-Fc 和 rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc。对昆虫细胞包装 rAAV 的重组杆状病毒比例、培养液血清含量以及培养温度、密度和时间进行了系统的优化,利用发酵罐培养制备的rAAV-Sn4D-SRCR59-Fc和rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc的滴度分别为8.4×109FFU/ml和3.2×109FFU/ml,具有典型的AAV形态和结构蛋白。两个rAAV转导细胞均能正确表达编码的可溶性受体,最高表达量分别为168.9ng/mL和158.1ng/mL,至少可持续表达120h。两个rAAV表达的可溶性受体均能明显阻断PRRSV感染PAM细胞,对4株PRRSV感染的阻断作用相似,其中SRCR59-Fc/Sn4D-Fc的阻断作用较强。与rAd-SRCR59-Fc对照组相比,两个rAAV注射小鼠的可溶性受体表达时间可延长21天。将rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc注射猪分别与3株PRRSV感染猪同居饲养,结果显示rAAV注射猪的直肠体温、临床症状、病毒血症、病理变化和病毒载量均有显著降低。这些结果提示rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc有望作为抗PRRSV感染制剂进一步开发。2.不同启动子和不同重组病毒介导的可溶性受体表达策略研究为了提高可溶性受体的表达水平和持续时间,先将猪EF1α启动子引入rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc,获得了 rAAV-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc。分别经两个rAAV转导后,PK-15细胞的可溶性受体最高表达量分别为72.2ng/mL和110.0ng/mL,3D4/21细胞的最高表达量分别为168.9ng/mL和246.2ng/mL,表达时间至少持续120h。分别用两个rAAV注射小鼠,结果显示rAAV-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc注射组的可溶性受体表达量显著高于rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc注射组,可持续表达35天。然后将EF1α启动子分别插入腺病毒（Ad）载体、猪伪狂犬病毒（PRV）载体和杆状病毒（Bac）载体,获得了 rAd-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、rPRV-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc 和rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc。分别用 4 种重组病毒转导 PK-15 和 3D4/21 细胞,结果显示rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc转导组的可溶性受体最高表达量（202.1ng/mL 和 402.8ng/mL）显著高于 rAd-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc 转导组（179.4ng/mL 和 307.4ng/mL）、rAAV-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc（105.3ng/mL 和211.2ng/mL）和 rPRV-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc（44.5ng/mL 和 103.6ng/mL）。PAM细胞经4个重组病毒转导后,rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc转导组的PRRSV滴度显著低于其它3个重组病毒转导组,且对4株PRRSV的感染具有阻断作用。在4个重组病毒注射小鼠中,rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc注射组的可溶性受体表达量最高,表达时间最长。这些研究结果表明,利用EF1α和rBac载体可有效提高PRRSV可溶性受体的表达水平和持续时间。3.Fc片段关键氨基酸突变对可溶性受体半衰期和抗PRRSV活性的影响为了提高可溶性受体的体内半衰期和累积浓度,利用PCR克隆技术将SRCR59-Fc/Sn4D-Fc的IgG Fc片段第455和461位蛋氨酸（M）和天冬酰胺（N）突变为亮氨酸（L）和丝氨酸（S）,将突变后的SRCR59-lsFc/Sn4D-lsFc编码序列插入杆状病毒载体后,获得了 rBac-GED-EF1α-SRCR59-lsFc/Sn4D-lsFc,能在昆虫细胞和猪源细胞中正确表达编码的可溶性受体,表达水平、表达时间及抗PRRSV活性均优于rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc表达的可溶性受体。用两个rBac注射小鼠,结果显示rBac-GED-EF1α-SRCR59-lsFc/Sn4D-lsFc注射组的可溶性受体表达时间较rBac-GED-EF1α-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc 注射组显著延长。与 SRCR59-Fc/Sn4D-Fc 可溶性受体相比,SRCR59-lsFc/Sn4D-lsFc可溶性受体在猪血浆的半衰期延长了 20.8h（96hvs 168h）,在猪体内的半衰期延长了 3.4天（7d vs 14d）,生物可利用度提高了 3.6%,对PRRSV感染PAM细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用和补体介导的细胞毒作用明显增强。这些研究结果表明Fc片段关键氨基酸突变能提高可溶性受体的累积水平、体内外稳定性和抗PRRSV活性。总之,本研究利用重组AAV成功介导表达了两种融合形式的PRRSV可溶性受体。两种融合策略研究显示,SRCR59-Fc/Sn4D-Fc融合表达形式具有更强的抗PRRSV活性,且适用于临床研究。表达策略进一步优化表明,EF1α启动子和重组Bac载体是显著延长可溶性受体融合表达的最佳组合。另外,通过Fc部分关键氨基酸突变可提高可溶性受体的稳定性和抗PRRSV活性,为PRRSV的防控提供了一种新的研究策略。