棉花是全世界最重要的纺织工业原料,棉花杂种优势的利用可以提高棉花产量,三系杂交制种是利用棉花杂种优势理想的工具。三裂棉细胞质雄性不育CMS-D8实现了三系配套,但尚未用于实践应用,且恢复基因Rf₂至今未成功克隆及功能验证。本研究期望对三裂棉细胞质雄性不育的恢复基因Rf₂进行定位并开发紧密连锁的InDel分子标记。研究结果不仅有助于缩短改良恢复系的周期,促进三裂棉细胞质雄性不育三系用于实践生产杂交制种,也为Rf₂的分离奠定了基础。本研究取得的结果主要为:1.本研究构建了1623个单株的BC1F1（（不育系×恢复系）×保持系）分离群体,育性调查结果显示群体内有850株可育单株、不育773株,其分离比符合1:1,表明CMS-D8育性恢复由单基因显性控制。2.采用亲本重测序,子代BSA重测序技术结合高通量SNP基因分型把Rf₂初步定位于D05染色体的54.11 Mb-55.99 Mb,候选区间大小为1.88 Mb。根据候选区间内的In Del变异开发出16个多态性InDel标记,通过对6个交换单株的分析,对Rf₂进行了精细定位,进一步把区间缩小到1.48 Mb。选择目标区间内与Rf₂基因共分离的InDel标记可用于恢复系改良过程中追踪Rf₂基因。3.获得了能同时区分恢复基因Rf₁和Rf₂的InDel1892标记,变异位点序列分析发现CMS-D8恢复系有32 bp插入,哈克尼西棉细胞质雄性不育CMS-D2恢复系有182 bp插入。InDel1892标记结合本课题前期开发的不育胞质相关的atpA SCAR标记可用于鉴定三系杂交种,并区分杂交种包含的恢复基因类型。4.采用实时荧光定量PCR分析了候选区间内的8个PPR家族基因在CMS-D8三系材料间的表达模式,结果发现Gh_D05G3391在恢复系中的表达量极显著低于不育系和保持系。结合本课题已有的CMS-D8三系的RNA-Seq数据,鉴定到一个编码NB-ARC结构域抗病蛋白基因Gh_D05G3374在恢复系中的表达量极显著高于不育系和保持系。