目的:观察褪黑素对骨肉瘤细胞增殖和迁移影响,并探讨PKA通路与Src通路介导CREB依赖性基因转录在上述调控过程中的作用。研究方法:对MG-63骨肉瘤细胞进行培养,应用不同浓度的褪黑素对其作用24小时后进行Transwell实验、Celigo划痕实验和CCK-8实验来验证褪黑素对骨肉瘤细胞增殖和迁移能力的影响;应用最适4m M的浓度的褪黑素、H89对其作用24小时后进行western blot实验以检测p-ERK1/2/p-p90RSK/p-CREB途径磷酸化的表达水平来验证PKA与CREB依赖通路的联系;应用4m M的褪黑素、PP2对其作用24小时后进行western blot实验以检测p-ERK1/2/p-CREB途径磷酸化的表达水平来验证Src与CREB依赖通路的联系;应用4m M的褪黑素、PP2对其作用24小时后进行western blot实验以检测c AMP的表达水平来验证c AMP-PKA与Src通路的关系。结果:(1)不同浓度褪黑素处理组中与对照组相比骨肉瘤细胞增殖均有减少;相比对照组,不同浓度褪黑素处理组Transwell转移率经T-test分析P<0.05;48小时划痕迁移率T-test分析P<0.05。证实不同浓度褪黑素对细胞的迁移均有抑制作用,且呈浓度依赖性。(2)经H89和褪黑素预处理的细胞中p-ERK1/2的表达仅略有下降。与此相反,单独使用H89处理可引起上调(P<0.05),表明PKA对ERK1/2级联具有明显的抑制作用。H89降低了CREB磷酸化的表达,在接受了除H89外的褪黑素治疗的细胞中,这种效果更加明显。此外,我们还测试了H89对CRE依赖基因转录活性的影响,结果发现H89导致CRE依赖基因转录活性略有降低,但加入褪黑素后抑制作用更加明显。(3)比较了PP2对褪黑素处理细胞和未处理对照组的影响,发现褪黑素组磷酸化的ERK表达显著降低(P<0.01),p-ERK1/2水平也显著降低。p-CREB表达也有类似的结果(P<0.01)。CRE-荧光素酶检测结果显示,CRE依赖基因转录活性也出现了同样的趋势。(4)褪黑激素降低了骨肉瘤中c AMP的水平,与PP2联合治疗并没有进一步的作用。结论:褪黑素对骨肉瘤细胞增殖、迁移有抑制作用,且呈浓度依赖性,其作用机制与PKA通路与Src通路平行参与介导CREB依赖性基因转录相关。