研究背景活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)是体内有氧代谢的副产物,参与了体内多种生理过程,在细胞信号转导及细胞防御中发挥重要作用。过多的ROS会引起疾病产生发展,与原发性高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病以及慢性肾病等密切相关。外周多巴胺是重要的血压调节因子,通过与细胞膜上多巴胺受体结合发挥作用。多巴胺受体为G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR),依据其结构及药理作用分为D1类和D2类两大类。其中D1类受体包括了D1和D5受体,D2类受体包括D2、D3和D4受体。D1类受体与Gαs结合促进腺甘酸环化酶活性,D2类受体与Gαi及Gαo结合抑制腺苷酸环化酶活性。多巴胺受体亚型均可发挥各自的特异性作用,通过调节上皮钠运输,平滑肌细胞收缩和氧化应激等参与血压的控制。其中多巴胺D1类受体不仅在尿钠排泄中发挥作用,也可参与调节氧化应激。如多巴胺D1受体(D1R)可抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS含量。多巴胺D5受体(D5R)可以负向调节NADPH氧化酶活性及表达,或上调内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO)等抑制ROS生成,参与血压调节。对氧磷酶(Paraoxonase,PON)属于内酯酶家族成员,包括三个成员:PON1、PON2及PON3,三者在氨基酸水平有约65%的相似性,但拥有不同的活性及功能。PON1、PON3在肝脏高表达,并与血液循环中与高密度脂蛋白结合,可以降低低密度脂蛋白的氧化修饰,减少氧化应激。而PON2在血浆中无表达,但在体内组织广泛分布,具备最强的内酯酶活性,可减少细胞内氧化型低密度脂蛋白及过氧化物生成,减少血管氧化应激,抵抗动脉粥样硬化。此外,在小鼠肾脏及人肾脏近端小管(Human renal proximal tubule,h RPT)上皮细胞上,PON2可抑制NADPH氧化酶的表达和活性,减少ROS生成,参与血压调节。脂筏(Lipid rafts,LRs)是细胞膜上富含鞘脂、胆固醇、糖脂以及特异性蛋白的有序微结构域,为细胞信号分子提供了作用的时间及空间平台,能够促进信号分子聚集、形成新的信号分子复合物、增强信号转导效率。脂筏与包括GPCR在内的多种信号分子有关,调节细胞氧化还原状态。例如,在牛冠脉内皮细胞上,激活死亡受体可以导致脂筏在胞膜聚集,促进NADPH氧化酶亚基的聚集和活化,增加ROS生成,与内皮功能不全有关。而在h RPT细胞,脂筏维持NADPH氧化酶于失活状态。激活多巴胺D1类受体可通过调节NADPH氧化酶亚基在LRs及非脂筏区(Non lipid rafts,non-LRs)重分布从而抑制NADPH氧化酶活性、抑制ROS生成。在h RPT细胞中,PON2分布于细胞膜LRs及non-LRs组分,并可能与多巴胺D2受体(D2R)在此相关联。根据以上内容,我们推测D1R和D5R可能也通过调节PON2,在抗氧化应激中发挥作用,并且该作用可通过LRs实现。我们通过短效及长效两个方面,观察PON2在D1类受体调控氧化应激中的作用,并比较D1R及D5R在调节作用中的差异。以上问题的解决有助于阐释多巴胺D1类受体抗氧化的新机制,为抗氧化药物的研制提供理论依据。研究目的研究多巴胺D1R和D5R对PON2的调节在肾脏细胞氧化应激中的作用。研究内容和方法1.以小鼠肾脏切片以及D1R转染HEK-293细胞(HEK-h D1R)及D5R转染HEK-293细胞(HEK-h D5R)以及h RPT细胞为研究对象,采用免疫荧光的方法,在激光共聚焦显微镜下观察多巴胺D1R与PON2以及D5R与PON2的各自表达情况以及是否存在共定位现象;多巴胺D1类受体激动剂fenoldopam短效刺激(1μM,15 min)后,D1R与PON2,D5R与PON2共定位现象是否发生改变。2.以HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞为研究对象,采用免疫共沉淀方法,观察中多巴胺D1R、D5R分别与PON2是否存在共连接;fenoldopam短效刺激(1μM,15 min)后,共连接是否发生改变。3.以HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞为研究对象,采用小分子干扰RNA(si RNA)转染技术沉默PON2基因,用免疫印迹法检测转染效果,用2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(2’,7’-dichlorofluoresceindiacetate,H2DCFDA)荧光法检测ROS生成,用光泽精发光法测NADPH氧化酶活性,观察PON2-si RNA在fenoldopam短效刺激(1μM,15 min)调节NADPH氧化酶活性中的作用。4.以HEK-h D1R、HEK-h D5R及h RPT细胞为研究对象,采用蔗糖密度梯度离心法提取细胞膜LRs及non-LRs组分,用免疫印迹法检测蛋白表达,观察fenoldopam(1μM,15 min)或胆固醇消耗剂甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,βCD)(2%,60 min)对PON2在细胞膜LRs及non-LRs分布的影响。5.在HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞上,用免疫印迹法观察fenoldopam刺激不同时间(1μM,2-24 h)对PON2蛋白表达的影响,以及用D1类受体阻断剂SCH 23390(1μM,24 h)对PON2变化的影响。定量PCR方法观察fenoldopam长效刺激(1μM,24 h)对PON2基因转录的影响。6.PON2-si RNA转染细胞沉默PON2基因,观察对NOX2表达的影响;观察PON2-si RNA在fenoldopam长效刺激(1μM,24 h)调节NADPH氧化酶活性中的作用。7.用免疫印迹法观察D5R基因敲除小鼠肾脏皮质PON2表达变化;在h RPT细胞上,用D5R-si RNA沉默D5R基因,免疫印迹法检测转染效果,观察对PON2、NOX2表达以及ROS生成的影响。8.用PON2-si RNA转染细胞沉默PON2基因,用H2DCFDA荧光法测ROS生成及光泽精发光法检测NADPH氧化酶活性,分别观察PON2在fenoldopam长效刺激(1μM,24 h)调节ROS生成及NADPH氧化酶活性中的作用。研究结果1.为了解D1类受体与PON2的作用是否通过直接的物理连接实现,我们首先进行了共定位检测。结果发现D1R、D5R与PON2在小鼠肾脏近端小管刷状缘上表达丰富,D1R与PON2以及D5R与PON2在小鼠肾脏近端小管刷状缘存在共定位;在h RPT以及HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞上,基础状态下D1R和D5R主要表达于细胞膜和细胞浆内,PON2主要表达在细胞浆内,D1R与PON2以及D5R与PON2有部分共定位,fenoldopam短效刺激促进D1R和D5R的内化,与PON2在细胞浆内的共定位增加。2.在HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞中,基础状态下D1R和D5R分别与PON2有共连接,并且fenoldopam短效刺激可以加强D1R与PON2、D5R与PON2之间的共连接作用。说明了D1类受体与PON2存在直接的物理作用。3.为检测PON2在D1类受体抗氧化中的作用,我们通过阻断PON2,再观察激动D1类受体效应的变化。结果发现:在HEK-h D1R、HEK-h D5R细胞中,PON2-si RNA组ROS生成增加,NADPH氧化酶抑制剂apocynin可以阻断ROS的增加效应;PON2-si RNA可以削弱fenoldopam短效刺激对NADPH氧化酶活性的抑制作用。证明PON2参与了D1类受体对NADPH氧化酶的抑制效应。4.我们推测D1类受体对PON2的调节可能有细胞膜LRs参与。通过蔗糖密度梯度离心法,观察到在HEK-h D1R细胞上,fenoldopam短效刺激导致LRs及non-LRs内PON2蛋白含量均升高;在HEK-h D5R及h RPT细胞上,fenoldopam刺激仅升高non-LRs内PON2蛋白含量而对LRs内PON2含量无明显影响。在这三种细胞上,βCD均能促进PON2从LRs向non-LRs组分内转移。这体现了D1R与D5R调节PON2的不同作用,可能与D1R与D5R不同的抗氧化机制相关。5.为检测PON2在D1受体长效抗氧化应激中的作用,首先观察长效激动D1类受体对PON2表达的影响。在HEK-h D5R细胞上,fenoldopam刺激可呈现时间依赖性地增加PON2蛋白表达,并且该效应可被D1类受体阻断剂逆转,而在HEK-h D1R细胞上,fenoldopam刺激对PON2蛋白表达无明显影响。Fenoldopam长效刺激还可升高HEK-h D5R细胞PON2 m RNA表达而对HEK-h D1R细胞无影响。这也证明了D1R与D5R对PON2的差异性调节。6.在HEK-h D5R细胞上,PON2-si RNA转染组NOX2表达上调,并且削弱fenoldopam长效刺激对NADPH氧化酶活性的抑制作用。证明PON2参与了D5R长效刺激对NADPH氧化酶活性的抑制。7.D5R基因敲除小鼠PON2表达下降;在h RPT细胞上,D5R-si RNA转染细胞PON2表达下降、NOX2表达上调;D5R-si RNA转染细胞ROS生成增加,该作用可被apocynin逆转。8.在h RPT细胞上,PON2-si RNA明显削弱了fenoldopam长效刺激对NADPH氧化酶活性及ROS生成的抑制作用。研究结论D1R和D5R通过对PON2的不同调控机制,以及在短效、长效作用中的不同作用发挥对氧化应激的差异性调节。其中,在短效作用中,D1R可通过上调LRs内PON2表达参与抗氧化调节,而D5R则促使PON2向non-LRs转位,可能通过其他的作用机制参与抑制氧化应激。在长效作用中,D1R对PON2表达无影响,而D5R通过上调PON2表达发挥抗氧化作用。本研究阐释了D1类受体在抗氧化作用中的新机制,以及受体亚型的差异性作用,为药物治疗提供了新的靶点。研究背景原发性高血压(Essential hypertension,EH)是最常见慢性病之一,影响着全世界超过10亿人健康。原发性高血压可导致卒中、心肌梗死以及心脏衰竭、肾脏衰竭等并发症,致残率、致死率高。高血压发病机制复杂,既有遗传因素也包括环境因素的影响。肾脏在高血压长效调节中发挥着重要作用,可通过调节水钠排泄参与调节血压,其中近端小管(Proximal tubule,PT)是肾单位中负责水钠重吸收的重要部位,重吸收原尿中约65%的水和钠。Na+-K+-ATP酶以及Na+-H+-转运体3(Na+-H+-exchanger-3,NHE3)作为小管上主要的钠转运体,在调节水钠重吸收过程中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ、多巴胺以及胰岛素等可通过调节肾脏近端小管(Renal proximal tubule,RPT)上Na+-K+-ATP酶以及NHE3活性调控水钠重吸收,参与血压控制。多巴胺在调节尿钠排泄中发挥重要作用,通过与多巴胺受体结合发挥作用。多巴胺受体属于G蛋白偶联受体,分为两大类:D1类(D1和D5受体),激活腺苷酸环化酶和D2类(D2、D3R及D4受体),抑制腺苷酸环化酶。多巴胺受体各亚型均存在于肾单位中,并在近端小管高表达。激动D1受体(D1R)或D3受体(D3R)可促进排钠利尿作用。在Wistar-Kyoto(WKY)大鼠来源的RPT(WKY RPT)细胞上,激活D3R可抑制Na+-K+-ATP酶活性。肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)在调控肾脏水钠排泄以及血压中具有关键作用,其中血管紧张素Ⅱ是主要效应肽,与血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R)和2型受体(AngiotensinⅡtype 2 receptor,AT2R)结合发挥功能。AT2R常表现为拮抗AT1R的生理效应,在成体肾脏因AT2R的表达远小于AT1R,约占血管紧张素Ⅱ受体的5%,其生理作用常被AT1R所掩盖。激动AT2R可促进Na+-K+-ATP酶及NHE3内吞失活,抑制钠的重吸收,促进尿钠排泄。多巴胺系统可通过与RAS、内皮素系统等其他血压调节系统相互作用,促进尿钠排泄,调节血压。例如,抑制肾小管血管紧张素II生成或阻断AT1R均可增加D1类受体激动剂fenoldopam的促尿钠排泄作用。D1类及D2类受体激动剂也可对抗血管紧张素II通过AT1R在近端小管管腔面的刺激钠转运作用。所有D1类受体包括D1R及D5R,均可参与与AT1R的相互拮抗作用。D2类受体,包括D2受体(D2R),D3受体(D3R)和D4受体(D4R)还可负性调控AT1R的表达。而AT2R可介导刺激D1类受体产生的促尿钠排泄作用,关于D2类受体与AT2R之间的作用尚无报道。在WKY RPT细胞,D3R负性调控AT1R的表达,但在自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)来源的RPT细胞上,该调节作用受损。D3R和AT2R均在RPT处表达并且都能抑制钠转运。根据以上内容,我们推测多巴胺D3R和AT2R之间可能存在交互作用,共同参与调节利尿排钠,以上问题的解决有助于丰富肾脏多巴胺系统与肾素-血管紧张素系统之间的相互作用,完善多巴胺系统在水钠排泄、血压调控中的机制研究。研究目的研究多巴胺D3R与AT2R的交互作用对肾脏水钠排泄的影响及机制研究。研究内容和方法1.采用肾动脉灌注技术,观察D3R受体激动剂PD128907和AT2R受体激动剂CGP42112A单独灌注及共同灌注对Wistar大鼠肾脏水钠排泄的影响,并在D3R受体阻断剂U99194A或AT2R受体阻断剂PD123319联合灌注时,观察PD128907及CGP42112A单独及共同灌注利尿排钠作用的变化。2.用哇巴因法检测PD128907和CGP42112A单独刺激或共同刺激WKY RPT细胞对Na+-K+-ATP酶活性的影响,并在U99194A或PD123319联合刺激时,检测PD128907及CGP42112A分别及联合刺激对Na+-K+-ATP酶活性影响的变化。3.采用免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察Wistar大鼠肾脏以及WKY RPT细胞上D3R与AT2R的各自表达情况,以及是否存在共定位,PD128907、CGP42112A单独或共同刺激后,共定位是否发生改变。4.以Wistar大鼠肾脏皮质匀浆及WKY RPT细胞为研究对象,采用免疫共沉淀方法,检测D3R与AT2R是否存在共连接,观察PD128907、CGP42112A单独或共同刺激后,共连接是否发生改变。5.探索WKY RPT细胞上D3R与AT2R相互作用的机制。研究结果1.为观察激活肾脏D3R与AT2R是否在大鼠体内交互作用而产生利尿排钠效应,我们首先通过肾灌注PD128907及CGP42112A,观察尿量及尿钠排泄变化。结果显示在Wistar大鼠上分别灌注PD128907与CGP42112A可产生促进水钠排泄的作用,并且分别被D3R或AT2R阻断剂所阻断。两药共同灌注可产生协同增强的排钠利尿作用,该作用可被D3R或AT2R受体阻断剂逆转。证明了共刺激D3R或AT2R可引起协同放大的促水钠排泄作用,并且与D3R或AT2R特异性相关。2.为检测D3R与AT2R在离体细胞实验中是否也存在交互作用而促进钠排泄,我们通过哇巴因法测定PD128907与CGP42112A对WKY RPT细胞Na+-K+-ATP酶活性的影响。结果显示PD128907与CGP42112A分别刺激WKY RPT细胞均可抑制Na+-K+-ATP酶活性,并呈现时间依赖性,该效应可分别被D3R或AT2R阻断剂逆转。PD128907与CGP42112A共同刺激时产生协同增强的抑制效应,D3R或AT2R阻断剂可阻断该效应。证明共刺激D3R或AT2R可以协同抑制Na+-K+-ATP酶活性,并且与D3R或AT2R受体特异性相关。3.为进一步观察D3R与AT2R之间是否存在直接的物理作用,我们通过激光共聚焦及免疫共沉淀技术进行检测。结果显示D3R或AT2R在Wistar大鼠肾脏和WKY RPT细胞上均存在共定位和共连接,PD128907与CGP42112A共同刺激WKY RPT细胞可协同增强二者的共定位及共连接。这证明D3R和AT2R存在物理性交互作用,共刺激时交互作用增强。4.因为D3R与AT2R信号传导均与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)相关,因此我们在机制研究中,观察了PD128907与CGP42112A共作用对磷酸化ERK的影响。结果显示共刺激D3R和AT2R时,磷酸化ERK表达协同增强,MAPK-ERK信号通路可能参与了D3R和AT2R的协同效应。再用MAPK抑制剂PD98059联合用药,观察对D3R和AT2R协同效应有无阻断作用。结果显示PD98059可逆转PD128907与CGP42112A共刺激对D3R和AT2R共定位及共连接的增强作用,并阻断了对Na+-K+-ATP酶活性的协同抑制效应。证明MAPK-ERK信号通路参与了D3R和AT2R协同效应。研究结论我们的研究表明,D3R与AT2R存在交互作用,共刺激时通过促进D3R或AT2R的正向交互作用、对Na+-K+-ATP酶活性的协同抑制,产生协同放大的利尿排钠效应,该效应与MAPK-ERK信号通路相关。本研究证明了多巴胺受体与血管紧张素Ⅱ受体的交互作用也可产生协同效应,这种同向的调节活动与受体间交互作用的增强以及协同激活共同信号通路相关。说明外周多巴胺系统与RAS之间除了相互拮抗发挥调节作用外,还可通过互相促进、协同增强的方式同向参与水钠调节。本研究揭示了多巴胺系统与RAS之间在水钠排泄中新的作用机制,为高血压的防治提供了新的依据。