论文部分内容阅读
目的在小鼠单倍体移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中探讨阻断整合素相关蛋白(Integrin Associated Protein,CD47)及其配体通路对aGVHD模型的影响,以研究CD47在aGVHD过程中是否起调控作用。并在小鼠单倍体移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中阻断整合素相关蛋白(Integrin Associated Protein,CD47)及其配体通路,探讨CD47单抗在aGVHD中发挥作用的具体机制。方法取雄性C57BL/6小鼠为供体小鼠,雄性C57 BL/6与雌性BALB/C小鼠杂交子一代(C57BL/6*BALB/C)的雌性小鼠为受鼠。将杂交子一代雌性小鼠分为两组,A1组给予尾静脉输注供体小鼠的骨髓细胞和脾细胞的处理,A2组给予尾静脉输注供体小鼠的骨髓细胞和脾细胞以及CD47单抗(B6H12)的混悬液的处理,观察各组存活时间,aGVHD的临床症状PAFS评分(评估aGVHD的临床症状的指标之一,包括姿势、活力、脱毛、弓背),小鼠的体重曲线以及病理观察皮肤、肝脏、小肠等靶器官的损伤程度。在移植后,+3d天收集各组小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,测定MHC-Ⅰ+CD3+细胞的CFSE峰值。同时收集各组小鼠脾脏来源的单个核细胞,Annexin-V、PI流式检测MHC-Ⅰ+CD3+细胞的凋亡、取得各组受体小鼠脾脏,抽提RNA,应用定量PCR技术测定T-bet、C-maf、GATA3的表达水平,并应用Western blotting技术验证。同时收集各组小鼠外周血上清,ELISA测定Th1细胞分泌的细胞因子(IFN-γ)、Th2分泌的细胞因子(IL-4)Th17分泌的细胞因子(IL-17a)等来探讨CD47单抗在a GVHD中的干预机制。结果A1组小鼠的中位生存期为35(24-44)d,均死于严重的aGVHD。而A2组小鼠中位生存期为43(31-59)d,对比A1组小鼠存活时间的差异有统计学意义(P<0.01)。A1组小鼠死亡时平均体重为(12.0±0.1)g,而A2组小鼠死亡时平均体重为(13.6±0.4)g,对比A1组小鼠死亡时的体重差异有统计学意义(P<0.01)。A1、A2组小鼠均在14天左右出现典型的aGVHD的临床症状:弓背、脱毛、萎靡、腹泻等。A1组小鼠的PAFS评分均值为12.8(8-18)分,而A2组的小鼠PAFS评分均值为8(3-13)分,二者差异有统计学意义(P<0.01)。A1组小鼠的病理表现符合++~+++度aGVHD改变,出现皮肤基底层细胞空泡样变性或坏死、海绵层水肿和上皮细胞坏死、灶性上皮与真皮分离,肝脏细胞出现的叶间胆小管变性或坏死面积在25%-75%之间,小肠上皮细胞片状坏死、灶性的黏膜裸露。A2组小鼠的病理表现符合+~++度aGVHD改变,皮肤无灶性上皮与真皮分离,肝脏小叶间单管变形或坏死面积小于50%,无肠粘膜裸露。移植后+3d流式细胞术检测小鼠外周血标记的供体淋巴细胞增殖状态,结果示A1、A2组CD3+CFSE-的细胞群频率分别为(84.83±2.32)%、(82.67±2.54)%,两组之间无统计学差异。移植后+10d流式细胞术检测小鼠脾脏来源的淋巴细胞的凋亡状态,A1、A2组的CD3+Annexin-V+PI-细胞群的频率分别为(9.76±6.57)%、(13.77±5.21)%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。移植后+10d,取得各组受体小鼠脾脏,抽提RNA,应用定量PCR技术测定A1、A2组的T-betm RNA的表达量分别为(1.86±0.67)、(0.39±0.18),两组间差异有统计学意义(P<0.05);A1、A2组的GATA3mRNA的表达量分别为(1.57±0.32)、(0.95±0.44),两组间差异有统计学意义(P<0.05);A1、A2组的C-maf mRNA的表达量分别为(0.97±0.21)、(0.30±0.02),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。并且检测血清后得出A1组小鼠IFN-γ的浓度值为(52.3±12.1)pg/ML,而A2组小鼠IFN-γ的浓度值下降为(34.3±6.27)pg/ML,差异有统计学意义(P<0.05)。A1组小鼠的IL-4的浓度值为(199.2±53.4)pg/ML,而A2组小鼠IL-4的浓度值上升为(271.4±59.83)pg/ML,差异有统计学意义(P<0.05)。A1组小鼠的IL-17a浓度值为(395.3±47.85)pg/ML,而A2组小鼠IL-17a的浓度值下降为(256.77±49.27)pg/ML,差异有统计学意义(P<0.05)。结论输注CD47单抗会延长aGVHD小鼠的存活时间,并且减轻aGVHD的病理表现以及有关的临床症状。并且在输注CD47单抗对aGVHD干预过程中,对供体T淋巴细胞的增殖没有较大影响,但促进了供体T淋巴细胞的凋亡;并且增加了Th2的细胞因子IL-4的表达,降低了Th-1细胞因子IFN-γ、Th-17的细胞因子IL-17a的表达;同时还降低了转录因子T-bet、GATA-3、C-maf的mRNA表达量。