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目的神经母细胞瘤是小儿时期最为常见的颅外实体肿瘤,高危病例临床进展迅速,且易早期发生远处转移,其治疗手段虽经不断改进和完善,但仍预后不良。目前多项研究表明相当比例的高危神经母细胞瘤同时存在MYCN和ALK基因异常改变,且二者显示出强大的协同作用,与肿瘤的迅速增殖、恶性转移和不良预后密切相关。RNAi具有强大的特定靶基因沉默特性,可通过下调和关闭基因表达调控细胞的各项活动及进行基因表达缺失下的功能研究。TAE684是最早发现的小分子ALK激酶抑制剂,目前部分ALK激酶抑制剂已用于肿瘤的分子靶向治疗并取得良好的抗肿瘤作用。但针对人神经母细胞瘤MYCN和ALK两种异常改变基因应用RNAi与ALK抑制剂联合治疗的研究尚未见报道。本研究拟在人神经母细胞瘤细胞系中选择出高表达MYCN和ALK的细胞系作为研究对象,以MYCN和ALK作为靶基因,利用RNAi和稳转株构建技术,以慢病毒作为基因载体建立靶向MYCN的干扰稳转人神经母细胞瘤细胞株；研究MYCN敲减对体外培养的人神经母细胞瘤细胞增殖和侵袭能力的影响；以及MYCN敲减与ALK抑制剂TAE684联合对人神经母细胞瘤细胞凋亡水平的影响,MYCN, ALK蛋白及部分凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和Cleaved Caspase 3表达水平的改变,并分析其可能机制；同时应用裸鼠成瘤技术建立人源性神经母细胞瘤成瘤动物模型,检测移植瘤生长情况,在体内进一步检测MYCN敲减与TAE684的联合作用,旨在探讨MYCN和ALK在人神经母细胞瘤细胞发生发展中的可能作用,为MYCN和ALK基因作为联合治疗靶点提供实验依据,为多基因改变的神经母细胞瘤的治疗提供新的思路,使肿瘤的分子靶向治疗更加高效和完善。方法1.应用荧光定量PCR和Western blot检测三株人神经母细胞瘤SH-SY5Y, SK-N-SH,SK-N-BE (2)细胞系MYCN mRNA和蛋白,ALK蛋白表达水平,从而筛选出高表达MYCN和ALK的人神经母细胞瘤细胞系。2.根据人MYCN基因信息设计并构建四个靶向MYCN的干扰质粒,筛选鉴定后与pLenti6.3/V5 Dest载体重组,并行慢病毒包装构建成为Lenti-EGFP-MYCN-miR’幔病毒表达载体,感染高表达MYCN和ALK的人神经母细胞瘤细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测四个Lenti-EGFP-MYCN-miR慢病毒表达载体对MYCN mRNA和蛋白表达的沉默效应,筛选出最佳干扰靶序列慢病毒表达载体。3.通过Blasticidin药物抗性筛选获得MYCN干扰稳转人神经母细胞瘤细胞株,并应用荧光定量PCR, Western blot检测MYCN干扰稳转株MYCN mRNA和蛋白表达水平,鉴定稳转株成功建立。4.体外实验中,应用CCK-8检测MYCN干扰稳转株MYCN基因敲减后人神经母细胞瘤细胞增殖水平,Transwell小室结合结晶紫染色检测细胞侵袭能力。5.体外实验中,MYCN敲减与TAE684联合作用下,应用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞凋亡水平,应用Western blot检测MYCN,ALK蛋白和Bcl-2, Bax, Cleaved Caspase -3蛋白表达情况,并分析其可能机制。6.应用高表达MYCN和ALK的人神经母细胞瘤细胞系建立人源性神经母细胞瘤荷瘤裸鼠模型,检测MYCN敲减与TAE684联合作用下肿瘤生长情况,并应用Western blot检测肿瘤组织MYCN,ALK蛋白表达水平。结果1.三株SH-SY5Y,SK-N-SH,SK-N-BE (2)细胞系细胞的MYCN mRNA及蛋白表达水平分别为0.090±0.010,0.340±0.026,87.867±2.316和0.0064±0.0003,0.3887±0.0027,1.2447±0.0301；ALK蛋白表达分别为0.0175±0.0005,0.0173±0.0006,0.2100±0.0200；SK-N-BE(2)细胞株为高表达MYCN和ALK的人神经母细胞瘤细胞系,可用于后续实验。2.酶切和测序证实四个靶向MYCN的Lenti-EGFP-MYCN-miR慢病毒载体构建成功,四个慢病毒表达载体感染SK-N-BE(2)细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测后,MYCN mRNA和蛋白的表达水平分别为0.577±0.015,0.333±0.016,0.090±0.010,0.197±0.015和0.833±0.049,0.563±0.040,0.300±0.020,0.387±0.015,其中Lenti-EGFP-MYCN-3-miR对MYCN抑制作用最为显著,为最佳干扰靶序列慢病毒表达载体。3.通过Blasticidin药物抗性进行靶向MYCN干扰SK-N-BE(2)稳转株筛选,并且用荧光定量PCR和Western blot检测稳转株MYCN mRNA及蛋白表达,结果显示分别为0.363±0.012,0.467±0.035,均较正常对照组和阴性对照慢病毒稳转组明显下降(P<0.05),成功建立MYCN干扰SK-N-BE(2)稳转株。4.体外实验中,CCK-8检测细胞增殖水平,结果显示MYCN干扰SK-N-BE(2)稳转株OD值自感染后第1d至第6d分别为0.258±0.012,0.335±0.016,0.383±0.076,0.597±0.023,0.767±0.021,0.989±0.060,其中第2d至第6d OD值较正常对照组和阴性对照慢病毒稳转组明显下降(P<0.05),阴性对照慢病毒稳转组较正常对照组轻微下降,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。细胞侵袭实验结果显示,MYCN干扰SK-N-BE(2)稳转组OD值为0.042±0.009,较正常对照组和阴性对照慢病毒稳转组明显下降(P<0.05)。5.体外实验中,在分别应用MYCN敲减,TAE684以及MYCN敲减联合TAE684作用下,流式细胞术检测细胞凋亡水平分别为28.867±0.764,22.593±0.075,51.623±0.137,Western blot检测MYCN蛋白为0.247±0.006,0.403±0.012,0.130±0.002,ALK蛋白为0.068±0.007,0.036±0.003,0.021±0.001,Bcl-2蛋白为0.192±0.005,0.190±0.015,0.056±0.010,Bax蛋白为0.314±0.008,0.161±0.003,0.435±0.024,Cleaved Caspase-3蛋白为0.807±0.041,0.949±0.003,1.452±0.020,与正常对照组、DMSO组、阴性慢病毒稳转组+DMSO组相比差异有统计学意义(P<0.05),MYCN敲减联合TAE684与分别应用MYCN敲减、TAE684组相比变化更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。6.应用SK-N-BE(2)成功建立裸鼠荷瘤模型,检测成瘤体积结果显示MYCN敲减组、TAE684组以及MYCN敲减联合TAE684组移植瘤体积分别为0.1097±0.008cm3,0.0930±0.0060cm3和0.0024±0.0003cm3,Western blot检测MYCN蛋白分别为0.345±0.020,0.650±0.033和0.217±0.023；ALK蛋白分别为0.054±0.002,0.042±0.005和0.010±0.001,与正常对照组、DMSO组、阴性慢病毒稳转+DMSO组相比明显下降(P<0.05),MYCN敲减联合TAE684与分别应用MYCN敲减、TAE684组相比变化更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.人SK-N-BE (2)细胞为高表达MYCN和ALK神经母细胞瘤系。2.成功构建的靶向MYCN基因的Lenti-EGFP-MYCN-3-miR幔病毒表达载体可高效感染SK-N-BE (2)细胞及抑制目的基因MYCN表达,经过Blasticidin药物筛选可建立MYCN干扰稳转SK-N-BE (2)细胞株。3. MYCN干扰稳转SK-N-BE (2)细胞株MYCN敲减后,细胞增殖能力和侵袭能力明显抑制。4. MYCN敲减联合TAE684可明显下调体外培养的SK-N-BE(2)细胞MYCN, ALK, Bcl-2蛋白表达,上调BAX, Cleaved Caspase-3蛋白表达,细胞凋亡水平明显增加,MYCN敲减联合TAE684可能通过对凋亡分子的调控来实现对细胞凋亡的诱导促进作用。5.应用SK-N-BE (2)细胞系可成功建立裸鼠荷瘤模型,MYCN干扰稳转SK-N-BE (2)细胞株MYCN敲减与TAE684联合作用可增强对靶基因MYCN,ALK蛋白表达的抑制作用,抑制裸鼠移植瘤的生长,具有体内抗肿瘤作用。