论文部分内容阅读
肺癌(lung cancer)是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85%,严重影响人们的生活质量。目前,关于这类疾病的发病机理仍然不清楚,其发生、发展的分子机理亟待阐明。近年来质谱技术发展迅速,为肿瘤研究提供了有力的研究手段。本实验利用2D LC-MS/MS蛋白质组学平台,结合同位素标记相对和绝对定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)技术以及SWATHTM (Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions, SWATHTM)非标记定量技术分析比较一对具有不同转移潜能肺癌细胞系SPC-A-1sci和SPC-A-1的差异分泌蛋白,筛选肺癌转移相关分子。第一部分：血清蛋白组分析方法的初步建立。利用安捷伦免疫亲和色谱系统有效去除人血清中14个血清高丰度蛋白,有利于下一步质谱鉴定出更多血清低丰度蛋白,为之后的实验研究奠定基础。去除高丰度蛋白后的血清,利用iTRAQ标记定量方法定量比较正常人与肺癌早期、中期及晚期病人的血清蛋白。第二部分：NSCLC转移相关分泌蛋白的定量分析。利用iTRAQ标记定量技术和SWATHTM非标记定量技术同时分析SPC-A-1sci和SPC-A-1的差异分泌蛋白,并分析、整合两种方法的定量效果,结果显示在两种方法中重复鉴定与定量的蛋白有326个,差异表达的蛋白110个,经过生物信息数据库软件预测,有96%的蛋白可通过分泌途径分泌。应用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot)检测差异蛋白在基因与蛋白水平的表达情况,结果与质谱定量趋势基本一致。此外,运用第一部分中蛋白组学分析血清的方法,比较早期肺癌病人组(Ⅰ和Ⅱ期)和晚期肺癌病人组(Ⅲ和Ⅳ期)的血清差异蛋白,共鉴定差异蛋白71个。ELISA检测质谱鉴定结果中差异最显著的蛋白(Complement C3)在血清样本中的表达情况,结果与质谱分析一致。结合血清和分泌上清的差异表达数据结果,发现CD109同时在晚期肺癌病人和高转移潜能肺癌细胞高表达,提示其可能与肺癌发生发展密切相关,具有潜在研究价值。第三部分：CD109表达量检测及生物功能的初步研究。qRT-PCR检测CD109在72对肺癌病人癌和癌旁组织中的表达,显示CD109在癌组织中显著增高,且在低分化肺癌组织中高表达。ELISA检测CD109在19例正常人和30例肺癌患者血清中的表达,显示CD109在肺癌病人血清中升高,且在晚期患者中升高显著。初步研究CD109的生物功能,通过siRNA干扰肺癌细胞中CD1 09的表达,检测细胞增殖、侵袭、迁移能力和细胞周期的变化情况,结果显示CD109对细胞周期与增值能力有显著影响,但是对细胞侵袭、迁移能力无影响。综合以上实验结果,提示CD109可能与NSCLC发展进程有关,可作为潜在的治疗靶点。