磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（phosphatidylinositol-specific phospholipase C,PI-PLC）是一种可以作用于磷脂酰肌醇（PI,PIP,PIP₂）上磷酸二酯键的磷脂酶。PI-PLC在工业应用方面有广阔前景,同时也是有用的科学研究工具,还具有替代抗生素来抵抗寄生虫的潜在价值。对PI-PLC纯化及其酶活性质的研究受到国内诸多实验室的广泛关注。PI-PLC在微生物中广泛表达,据报道蜡样芽孢杆菌来源的PI-PLC不作为毒力因子,因而本研究选择蜡样芽孢杆菌来源的PI-PLC在大肠杆菌中进行异源表达。为了提高表达效果,本研究首先按照大肠杆菌密码子的偏好性对蜡样芽孢杆菌来源的PI-PLC密码子进行优化。构建基因表达载体pET-28a-PI-PLC和pGEX-6P-1-PI-PLC,并将其分别转入大肠杆菌BL21/DE3,进行表达纯化。实验结果表明利用载体pGEX-6P-1-PI-PLC表达PI-PLC时,利用重组PI-PLC的GST标签可以收到良好的纯化效果,转接量为5%、诱导剂IPTG添加浓度为0.3 mmol·L^-1、菌体长至OD₆₀₀达0.5、16°C发酵24 h,为最佳诱导条件。在该条件下表达重组PI-PLC并纯化后,将纯化后的PI-PLC作为后续研究对象。初步探究酶学性质后发现:纯化后的重组PI-PLC比酶活为1322.5 U·mg^-1;重组PI-PLC酶解标准底物的能力在75°C时达到最高;重组PI-PLC在pH较高条件下仍具有较高活性;Co²⁺和Ca²⁺离子对重组PI-PLC酶活有明显的促进作用、Mg²⁺离子对重组PI-PLC酶活有轻微的抑制作用;重组PI-PLC在4°C条件下较为稳定。利用重组PI-PLC处理贴壁细胞可以发现:37°C条件下在PBS缓冲液中,重组PI-PLC对人浸润性膀胱癌细胞YTS-1、人非浸润性膀胱癌细胞KK47及人膀胱移行细胞癌细胞J82表面GPI锚定蛋白CD59的酶切效果良好;PI-PLC处理1.5 h及以上可以达到较好的酶切效果,且细胞密度与酶切效果呈负相关。将GPI信号肽与唾液酸酶Neu-1基因融合表达后,可将原来胞内表达的Neu-1蛋白以GPI锚定结构表达在YTS-1细胞的细胞膜上,利用本实验表达纯化的重组PI-PLC对新构建的细胞株进行原位酶切处理,可确定Neu-1蛋白位置由胞内转至细胞膜上,且与细胞膜连接方式为GPI锚定结构。综上所述,本研究实现了PI-PLC的异源表达和纯化,且重组PI-PLC具备较高酶活,能够较好地酶切细胞表面的GPI锚定蛋白,可利用其这一特性将其应用于对GPI锚定蛋白的研究。