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目的:肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,早期诊断率不高,肾癌患者常伴有全身转移,术后复发率高且患者生存率低。肾癌对化疗和放疗均不敏感,尽管免疫治疗和抗血管生成靶向治疗的出现使肾癌患者的存活率得到了提高,但是免疫治疗引起的严重不良反应以及靶向治疗药物的副作用和耐药性对肾癌的治疗提出了挑战。因此,深入研究肾癌进展的分子基础,开发新的靶向抗癌药物,对于提高肾癌患者的生存率具有重要意义。此外,RCC常发生广泛的代谢重编,异常的肿瘤代谢物在癌症进展中发挥着重要作用。因此,通过鉴定肿瘤代谢物以及靶向参与RCC失调代谢途径的关键蛋白质或酶来探究新的肾癌治疗靶点和生物标志物,并将其应用于诊断和判断预后具有重要意义。补体C1q结合蛋白(Complement C1q binding protein,C1QBP)是一种高度保守的多功能蛋白,在炎症、感染、能量代谢和癌症中发挥重要作用。研究表明,C1QBP在乳腺癌、结肠癌、胃癌等癌症中高表达,并且与患者的不良预后相关。此外,C1QBP作为线粒体基质蛋白,对维持细胞氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生以及能量代谢的平衡至关重要。与其他肿瘤不同,我们先前的研究证实C1QBP在RCC中低表达,敲低C1QBP促进RCC细胞的粘附和侵袭。但C1QBP在RCC嘌呤代谢、氧化应激和细胞凋亡中的作用机制尚未阐明。本研究将在体内和体外实验探究C1QBP通过调节黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)的表达来调节肾癌细胞次黄嘌呤的分解代谢、ROS水平以及细胞凋亡,阐明C1QBP对肾癌细胞次黄嘌呤代谢的影响,解析C1QBP抑制肾癌进展的机理,为肾癌的治疗靶标提供新的分子理论基础。方法:1.利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建C1QBP差异表达的稳定的ACHN和786-O肾癌细胞系;应用real-time PCR和western blot方法验证C1QBP的m RNA及蛋白的表达水平。2.利用代谢组学技术检测肾癌细胞786-O对照组与C1QBP过表达组之间差异表达的代谢物。3.在肾癌细胞ACHN和786-O中分别检测C1QBP降表达与过表达后对次黄嘌呤含量的影响。4.在肾癌细胞ACHN和786-O中利用western blot和real-time PCR技术分别检测C1QBP下调和上调对XDH蛋白及m RNA水平的影响。5.利用western blot和免疫组化技术检测C1QBP与XDH蛋白在肾癌与癌旁组织中的表达及分布;并利用统计学方法进行C1QBP与XDH相关性分析,C1QBP及XDH与临床病理参数的相关性分析。6.在肾癌细胞ACHN和786-O中,利用酶标仪和流式细胞仪分别检测C1QBP降表达与过表达对ROS产生以及细胞凋亡的影响。7.在肾癌细胞ACHN和786-O中,应用western blot技术分别检测C1QBP降表达和过表达对凋亡相关蛋白活化的caspase-3和bax/bcl2表达的影响。8.在肾癌细胞ACHN和786-O中,应用real-time PCR和western blot技术验证转染XDH-si RNA沉默XDH m RNA和蛋白表达的效率;应用流式细胞仪检测XDH敲低对C1QBP诱导的ROS产生以及凋亡的影响。9.在肾癌细胞ACHN和786-O中,应用western blot技术检测敲低XDH的表达对C1QBP诱导的凋亡相关蛋白活化的caspase-3和bax/bcl2表达的影响。10.构建裸鼠肾原位人肾癌ACHN细胞异种移植瘤模型,应用小动物活体成像仪检测C1QBP过表达对原发肿瘤及肝肺转移的光信号强度的影响;对原位肿瘤进行称重;通过H&E染色检测肝肺转移灶;免疫组化检测原位肿瘤中C1QBP对XDH及凋亡相关蛋白caspase-3和bax/bcl2表达的影响。结果:1.成功构建C1QBP降表达的稳定肾癌细胞系:ACHN-sh C1QBP/Scr、786-Osh C1QBP/Scr细胞,C1QBP的m RNA(***P<0.001)及蛋白水平均下调;成功构建C1QBP过表达的稳定肾癌细胞系:ACHN-C1QBP/p CDH、786-O-C1QBP/p CDH细胞,C1QBP的m RNA(***P<0.001)及蛋白水平均上调。2.代谢组学实验检测到109种代谢产物,在786-O细胞中,与对照组相比,C1QBP过表达导致差异表达的代谢物有17种,其中次黄嘌呤含量的变化最显著,降低至对照组的0.2倍(*P=0.01)。3.与代谢组学结果一致,在ACHN和786-O细胞中,与对照组相比,C1QBP过表达使次黄嘌呤含量减低(***P<0.001),C1QBP降表达使次黄嘌呤含量增多(***P<0.001)。4.在肾癌细胞ACHN和786-O中,C1QBP在m RNA(**P<0.01)及蛋白水平上均正向调节XDH的表达。5.Western blot和免疫组化结果表明,与癌旁组织相比,C1QBP与XDH在肾癌组织中表达显著降低(*P<0.05,***P<0.001),且二者成正相关(**P<0.01,***P<0.001);C1QBP与XDH的表达均与Fuhrman分级有关(*P<0.05),与患者性别、年龄和肿瘤大小无关,此外,C1QBP的表达还与患者TNM分期有关(*P<0.05),而XDH的表达与患者TNM分期无关。6.C1QB正调控肾癌ACHN和786-O细胞的ROS产生和凋亡(*P<0.05,***P<0.001)。7.C1QBP正调控肾癌ACHN和786-O细胞的促凋亡蛋白caspase-3的活化和bax的表达,负调控抗凋亡蛋白bcl2的表达。8.在ACHN和786-O细胞中转染XDH的小干扰RNA,成功敲低XDH的m RNA(***P<0.001)及蛋白水平;敲低XDH能显著抑制C1QBP诱导的ROS产生(***P<0.001)和细胞凋亡(*P<0.05,**P<0.01)。9.敲低XDH能显著抑制ACHN和786-O细胞中C1QBP诱导的caspase-3的活化和bax的表达增多,恢复C1QBP介导的bcl2的表达抑制。10.与对照组相比,C1QBP过表达后,肾原位肿瘤、肝和肺的光信号强度减弱,肾原位肿瘤体重显著减低(***P<0.001);H&E染色结果表明,C1QBP过表达使肝和肺的转移灶显著降低(***P<0.001);IHC结果表明,C1QBP能促进裸鼠肾原位肿瘤蛋白XDH、bax和caspase-3的表达,抑制bcl2的表达。结论:1.C1QBP抑制肾癌细胞中次黄嘌呤的含量。2.C1QBP能在肾癌细胞中正向调节XDH的表达,且二者均在肾癌组织中低表达,表达呈正相关,肾癌患者组织中C1QBP和XDH的低表达均与高的Fuhrman分级有关,此外,C1QBP的低表达还与高的TNM分期有关。3.C1QBP促进肾癌细胞的ROS产生、细胞凋亡以及bax和活化的caspase-3的表达,抑制bcl2的表达。4.C1QBP通过上调XDH的表达促进肾癌细胞的ROS产生、细胞凋亡以及bax和活化的caspase-3的表达,抑制bcl2的表达。5.在肾癌裸鼠移植瘤模型中,C1QBP促进XDH的表达,调控凋亡相关蛋白的表达,抑制肿瘤的大小以及肝肺的转移。