肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,根据最新的全球癌症统计数据显示,肺癌发病率占所有恶性肿瘤的11.6%,死亡率占所有恶性肿瘤的18.4%,均居第一位。肺癌可按病理类型分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC),其中,NSCLC占所有肺癌的85%,肺腺癌是NSCLC中的主要病理类型。尽管肺癌的传统治疗手段包括手术(早期)、放疗、化疗等得到极大的提高与改进,但对肺癌患者的生存率并无很大的改善。近年来,靶向治疗(如表皮生长因子受体抑制剂)、免疫治疗(如PD-1单抗)等新的治疗手段逐渐运用于肺癌的治疗中,然而其耐药性及副作用的产生极大程度上限制了对患者的治疗疗效。数据显示,即使在发达的美国,肺癌的五年生存率也仅仅只有19%。因此,寻找新的更有效的治疗手段对提高肺癌患者的生存率及生活质量迫在眉睫。蛋白激酶D(protein kinase d,PKD)是一种非受体丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,属于钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,CAMK)家族。PKD包含三种高度保守的家族成员:PKD1,PKD2和PKD3。PKD2基因编码大小为105kDa的878个氨基酸的蛋白质,同其他蛋白激酶一样,PKD2受磷酸化激活,目前已知的磷酸化位点有位于催化结构域的706位丝氨酸(Ser706)和710位丝氨酸位点(Ser710),还有位于第876位丝氨酸(Ser876)的自身磷酸化位点。在静息细胞中,PKD2大部分定位于细胞质中,当受到细胞内外如激素、生长因子、佛波酯、G蛋白偶联受体激动剂等刺激时,PKD2可被磷酸化或发生自身磷酸化激活,转移至细胞的不同结构,并作用于不同的蛋白底物,传递信号信息。随着PKD2的分子克隆被报道,其在各种肿瘤中的作用也逐渐被人们关注。近年来的研究表明,PKD2在包括前列腺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、恶性胶质瘤在内的多种肿瘤中表达,并发挥促肿瘤作用。在肿瘤细胞中,PKD2激活后可通过PI3K/AKT/GSK3 β β-catenin、IKK β/NF κ B、HIF-1 a/VEGFA、MEK/ERK等细胞通路参与调控细胞生长、促进细胞增殖、调控细胞周期、调节肿瘤免疫反应、促进血管生成、促进肿瘤细胞的侵袭迁移、促进细胞存活和抗凋亡等细胞生物学行为。侵袭和迁移,作为恶性肿瘤的常见生物学行为之一,严重影响着肺癌患者的生存率和生存质量,由于早期诊疗手段的限制,多数患者在初次诊断时就已经发生了远处转移。上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是上皮来源恶性肿瘤的重要生物学行为之一,指的是细胞的上皮表型向间质表型转化。EMT的发生使上皮细胞之间连接减少,组织结构松散,肿瘤细胞侵袭、迁移能力增加,并赋予其一定的细胞干性以及抗凋亡、抗衰老等特性。研究表明PKD2可以促进前列腺癌、恶性胶质瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的侵袭和迁移,然而其在肺癌尤其肺腺癌中的作用尚不明确。本研究通过生物信息学分析方法发现PKD2的高表达与肺癌的发生发展、淋巴结转移具有明显的相关性,免疫组化染色分析结果表明,PKD2高表达是肺腺癌患者的不良的预后因素,我们通过细胞实验发现PKD2的促癌作用是通过调控p65表达诱导肺腺癌细胞发生EMT实现的,并通过体内体外实验证实PKD2对肺腺癌细胞生物学行为的作用,旨在阐明PKD2发挥促癌作用的具体机制,为肺腺癌的治疗提供新的靶点和理论依据。第一部分PKD2在肺腺癌中的表达及预后作用研究[研究目的]1.探讨PKD2在肺腺癌中的表达情况及作用。2.明确PKD2在肺腺癌病人中的预后作用及其与临床病理特征之间的关系。3.探讨肺腺癌组织中PKD2与E-cadherin表达水平之间的关系。[研究方法]1.采用生物信息学方法分析PKD2在肺癌中的作用:GSEA分析PKD2表达情况与肺癌发生发展之间的关系,Kaplan-Meier plotter分析PKD2表达在肺癌患者中的预后作用,采用TCGA数据分析PKD2与淋巴结转移之间的关系。2.收集27对肺腺癌手术病人肿瘤组织与癌旁正常组织,提取总RNA,采用qRT-PCR方法验证PKD2在肿瘤组织中的表达情况,并分析其与淋巴结转移、分期等之间的关系。3.对109例肺腺癌手术患者的肿瘤组织进行石蜡切片,免疫组织化学染色PKD2,分析其在肺腺癌病人中的预后作用,及其与临床病理特征之间的关系。4.免疫组化染色E-cadherin,分析PKD2与E-cadherin之间的关系。选取PKD2高低表达的两例肿瘤组织对同一肿瘤部位E-cadherin染色,分析两者表达之间的关系。[结果]1.生信分析结果显示,PKD2与肺癌的发生发展显著相关,高表达PKD2的肺癌患者预后不良,且与淋巴结转移相关。2.qRT-PCR证实PKD2在肺腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,PKD2高表达与淋巴结转移、高分期等显著相关(p<0.05)。3.免疫组化染色结果分析发现,PKD2高表达的患者具有更低的总生存期(p=0.015)及无进展生存期(p=0.006),是肺腺癌患者的独立预后因素(HR=2.150,95%CI=1.136-4.071,p=0.019)。4.PKD2与E-cadherin表达水平呈负相关(p=0.021),高表达PKD2的肺腺癌肿瘤组织E-cadherin低表达,低表达PKD2者E-cadherin高表达。[结论]1.PKD2在肺腺癌肿瘤组织中高表达,且与淋巴结转移、高分期有关。2.肺腺癌患者中PKD2高表达与预后不良显著相关,是肺腺癌患者的独立预后因素。3.肺腺癌中PKD2与E-cadherin呈负相关,提示PKD2可能通过促进肿瘤细胞的上皮间质转化发挥其促肿瘤作用。第二部分PKD2促进肺腺癌细胞上皮间质转化的作用及机制研究[研究目的]1.明确PKD2在肺癌各细胞系中的表达情况,探讨其在PMA的作用下在A549及PC9细胞系中的激活情况。2.分别敲低和过表达PKD2,探讨其在转录水平以及蛋白水平对EMT指标及相关转录因子的调控作用。3.探讨PKD2高低表达对NF κ B通路关键因子p65的表达调控作用。4.体内体外研究明确PKD2对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的作用。[研究方法]1.Western blot检测各细胞系PKD2的表达情况,选取A549和PC9两个细胞系进行PMA刺激下PKD2的磷酸化情况。2.分别向A549和PC9转染PKD2过表达质粒,PCR验证表达效率以及PKD2与EMT指标在mRNA水平的相关关系,western blot验证PKD2与EMT指标在蛋白水平表达关系。3.构建PKD2敲低稳转细胞系,PCR、western blot分别验证敲低效率以及PKD2与EMT指标在转录及蛋白水平上的相关关系。4.采用免疫组化染色、PCR、western blot等实验方法验证PKD2对p65表达的调控作用。5.SRB染色、Transwell、EDU染色、细胞周期等实验方法验证PKD2对肺腺癌细胞生物学行为的影响。6.使用稳转细胞系建立裸鼠皮下成瘤模型,体内验证敲低PKD2对肺腺癌细胞增殖等的影响。[结果]1.细胞实验验证,PKD2高表达在mRNA及蛋白水平上促进Vim、N-cadheri n、MMP-9、MMP-3等EMT指标及snail1、snail2、zeb1、twist等EMT转录因子的表达,PKD2敲低稳转细胞系中,EMT指标则降低。且EMT指标变化与PMA刺激无关。2.免疫组化染色发现,高表达PKD2的肺腺癌组织p65表达增高,而PKD2低表达抑制p65表达。3.转染PKD2后,A549、PC9等肺腺癌细胞系中p65在mRNA及蛋白水平均增高,敲低PKD2后,p65表达降低。4.抑制NF κ B通路后PKD2对EMT促进作用被抑制。5.细胞生物学行为实验表明,敲低PKD2抑制肺腺癌细胞的侵袭、迁移、增殖,并引起细胞G2/M期阻滞。6.裸鼠皮下成瘤证实敲低PKD2后,A549成瘤生长速度显著减慢。[结论]1.PKD2在肺腺癌细胞系中促进EMT的发生。2.PKD2能明显促进p65表达,抑制NF κ B通路后明显抑制了PKD2的促EMT作用,说明其可能是通过NF κ B/p65通路发挥促进EMT的作用的。3.PKD2可以促进肺腺癌细胞系的增殖、侵袭、迁移。并可在体内促进肿瘤细胞增殖。4..研究证实PKD2可以通过NF κ B通路促进EMT的产生促进肺腺癌的发生发展,靶向PKD2有望成为肺腺癌治疗中的新策略。第三部分基于SEER数据库的转移性非小细胞肺癌Nomogram预后模型的构建[研究目的]本研究的目的是构建个体化预测模型,以预测转移性NSCLC患者的生存概率。[研究方法]1.我们在SEER数据库筛选了 2010年至2013年诊断为转移性NSCLC的11558名患者。2.所有患者按照75:25的比例随机分为模型构建队列(8670例)和验证队列(2888例),Cox回归分析以选择独立预后因素。3.我们使用一致性指数(C指数),校准曲线,决策曲线分析(DCA)评估了模型的准确性和可靠性。[结果]1.根据Cox回归分析结果,性别、年龄、人种、婚姻状态、原发部位、病理类型、分化程度、T分期、N分期、转移器官及是否化疗等因素纳入模型构建。2.模型对1年、2年生存率的预测C指数分别为0.732及0.730。预测效能较好。3.校准图显示了nomogram预测与实际观察值之间的良好一致性。DCA测试了模型的良好临床适用性。Nomogram的预后准确性优于第七版AJCC TNM分期。在模型构建和验证队列中,低风险组的总生存率明显优于高风险组。[结论]我们通过SEER数据库构建并验证了转移性非小细胞肺癌Nomogram预后模型,有望在临床工作中指导晚期转移性NSCLC的治疗及预测患者预后。