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血栓类疾病作为一个严峻的全球性医疗问题,正在以惊人的发病率危害着人类健康,发病年龄在近几年逐渐呈现年轻化的趋势,同时也造成了巨大的经济损失和社会负担。目前,临床上经常使用的血栓治疗方法存在着种种弊端,如手术取栓创伤大且适用病人类型受限,纤溶酶原激活剂类溶栓药物有效作用时间短、常见出血副作用等,因此现阶段急需寻找一种新型的高质量溶栓药物。枯草杆菌纤溶酶是一种与纳豆激酶功能相似的丝氨酸蛋白酶,具有靶向降解交联纤维蛋白的特点,在体外和体内均能发挥纤溶功效,但枯草杆菌天然发酵获得的纤溶酶产量、纯度和溶栓活性都比较低,因此王业富课题组在前期的工作中,构建了高效表达重组纤溶酶QK-2蛋白的毕赤酵母基因工程菌,并借助武汉真福医药股份有限公司的发酵工艺放大车间及分离纯化平台实现了纤溶酶QK-2的高效表达,得到了高纯度(98.1%)、高活性(80万IU/g)的重组纤溶酶QK-2冻干粉。纤溶酶在体外、体内的溶栓作用及其静脉注射给药方式对血栓的影响已被观察到,但其口服溶栓作用尚不清楚,在此基础上,本研究旨在探究重组表达的纤溶酶QK-2作为口服溶栓药物的肠道吸收特性,初步验证重组纤溶酶QK-2在动物血栓模型基础上的溶栓功效,探讨其在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的作用机制,为纤溶酶蛋白药物的开发提供理论基础,为血栓类疾病的预防和治疗提供新的用药选择。具体研究内容可以分为以下三个方面:(1)在体外验证了重组纤溶酶QK-2在能够特异性地溶解交联的纤维蛋白(血栓重要组成部分)且对人工肠液(主要成分为胰蛋白酶)具有较强的耐受性;体外外翻肠囊模型显示重组纤溶酶QK-2能够经小肠不同部位(十二指肠、空肠、回肠)吸收,且吸收进入小肠后仍然具有明显的溶栓活性。此外,动物口服重组纤溶酶QK-2后的活体成像结果也表明重组纤溶酶QK-2在体内有较好的吸收效果;(2)通过评估健康大鼠口服重组纤溶酶QK-2一周后血浆中纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物(FDP)和D-dimer水平的变化,得出了重组纤溶酶QK-2对纤溶系统具有激活作用的结论。此外,利用角叉菜胶致炎的方法成功建立了大鼠血栓模型,并在此模型的基础上评估了血栓大鼠口服重组纤溶酶QK-2一周后的血栓疏通情况,在形态学和组织学水平上均检测到明显的血栓改善;(3)探讨重组纤溶酶QK-2在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的作用机制,为其发挥溶栓功效提供理论依据。在一定剂量范围内,重组纤溶酶QK-2处理HUVEC细胞后,细胞中组织型纤溶酶原激活物(t-PA)在mRNA和蛋白水平的表达量均被明显上调,而纤溶酶1型纤溶酶原激活抑制剂(PAI-1)则表现出完全相反的趋势。重组纤溶酶QK-2能够通过上调纤溶酶原激活剂进而激活纤溶系统,同时亦能减弱纤溶酶原激活抑制剂对纤溶系统的抑制作用,实现高效溶栓。本研究在高纯度、高活性的重组纤溶酶QK-2冻干粉基础上,发现了重组纤溶酶QK-2具有作为蛋白溶栓药物的口服吸收可能性,在体外、体内均证实了重组纤溶酶QK-2蛋白有较好的吸收效果且被吸收后仍能保持明显的的溶栓活力。相关动物实验证明了口服重组纤溶酶QK-2能够显著降低体内血栓形成的风险,且对体内已经产生的血栓有较好的疏通、改善作用。最后在细胞水平验证了重组纤溶酶QK-2对纤溶系统成分具有调控作用,能够有效激活纤溶系统的溶栓活力。本研究为重组纤溶酶QK-2作为血栓类疾病治疗药物提供了一种新的用药思路,为蛋白类口服溶栓药物应用于临床提供了机制、药效方面的理论依据。