【摘 要】
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DNA修复蛋白RAD51（DNA repair protein RAD51 homolog 1）是真核生物进行同源重组修复的核心蛋白,与单链DNA（ss DNA）和双链DNA（ds DNA）结合后显现出DNA依赖的ATP酶活性。在同源重组修复过程中,RAD51蛋白和ss DNA结合形成RAD51核酸蛋白纤维,寻找并入侵同源DNA实现及时准确的DNA同源重组修复,对维持基因组稳定和癌症治疗发挥重要作
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DNA修复蛋白RAD51（DNA repair protein RAD51 homolog 1）是真核生物进行同源重组修复的核心蛋白,与单链DNA（ss DNA）和双链DNA（ds DNA）结合后显现出DNA依赖的ATP酶活性。在同源重组修复过程中,RAD51蛋白和ss DNA结合形成RAD51核酸蛋白纤维,寻找并入侵同源DNA实现及时准确的DNA同源重组修复,对维持基因组稳定和癌症治疗发挥重要作用。研究RAD51蛋白及其突变体的活性,可以更好地理解RAD51在DNA损伤修复等生命活动中的重要意义。本文以人源RAD51（Homo sapiens RAD51,h RAD51）和猪源RAD51（Sus scrofa RAD51,s RAD51）为研究对象,构建了大肠杆菌h RAD51和s RAD51表达载体,优化h RAD51和s RAD51在大肠杆菌表达系统中的表达和纯化方案,得到了纯度高于95%的h RAD51和s RAD51蛋白。继而利用圆二色光谱、荧光各向异性、Na+K+-ATP酶活性检测等方法对h RAD51和s RAD51的二级结构、DNA结合活性、ATP酶活性进行研究。实验得到主要结果如下:（1）合成序列优化后的hrad51和srad51基因可以在原核表达系统（E.coli）中大量表达,结合Ni-NTA亲和层析柱和Superdex 200尺寸阻排色谱柱的纯化方法,可获得高纯度h RAD51和s RAD51蛋白。（2）在p H4的柠檬酸磷酸缓冲液中,h RAD51和s RAD51的二级结构发生较大改变。（3）h RAD51显示出强烈的Mg2+或Ca2+依赖性和ATP依赖性,结合活性会随着DNA长度的增加而增强;s RAD51没有显示出Mg2+、Ca2+和ATP依赖性,结合活性也会随着DNA长度的增加而增强。（4）h RAD51处于p H3.5的酸性或p H10的碱性环境时,其ATP酶活性受到较大影响,而s RAD51 ATP酶活性受到的影响较小;当环境中存在终浓度为3.4 m M Co2+或Mn2+均会削弱h RAD51和s RAD51水解ATP的能力。本研究探索并优化了h RAD51和s RAD51的原核表达及纯化方法,对h RAD51和s RAD51的DNA结合活性、不同环境下的ATP酶活性进行初步测定分析,为后续h RAD51和s RAD51生物学功能的进一步深入探索和对内源性s RAD51高分辨率结构的研究工作奠定基础。
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