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铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是兰科石斛属植物,九大仙草之首,富含多糖、黄酮、生物碱、松柏苷、紫丁香苷、丁香醛等次生代谢产物。使用原球茎代替成苗进行次生代谢产物生产,是实现野生石斛资源可持续利用的有效方式之一。温度是植物体内物质积累的重要影响因子,昼夜温差对作物光合、生理特性、花芽分化、物质积累及产量品质等方面均有显著影响。本文以铁皮石斛原球茎为材料,优化了铁皮石斛原球茎增殖体系;建立了同时测定铁皮石斛中松柏苷、紫丁香苷的方法;分离了DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因cDNA序列及DcCAD基因启动子序列;通过定量PCR分析了DcF5H、DcCOMT、DcCAD表达量的变化与松柏苷、紫丁香苷含量在不同温差处理下的相互关系。主要研究结果如下:1铁皮石斛原球茎增殖条件优化以铁皮石斛原球茎为材料,1/2 MS+50 g/L土豆泥为基础培养基,研究碳源、氨基酸以及不同培养方式对其增殖的影响。结果表明:添加葡萄糖为碳源,原球茎团块细小,颜色呈绿色,无分化,30 d时增殖系数为3.75,利于原球茎增殖;基础培养基添加氨基酸不利于原球茎增殖;悬浮培养铁皮石斛原球茎30 d时,原球茎增殖系数为固体培养的2倍,故悬浮培养可以作为提高其增殖系数的手段;25/21℃昼夜温差能够推迟分化有利于铁皮石斛原球茎的增殖。综上可得,在4℃昼夜温差条件下,使用1/2 MS+50 g/L土豆泥+25 g/L葡萄糖的培养基进行悬浮培养,最适合铁皮石斛原球茎增殖。2 UPLC法测定铁皮石斛原球茎中松柏苷、紫丁香苷建立超高效液相色谱同时测定铁皮石斛中松柏苷、紫丁香苷的方法,为探究昼夜温差对铁皮石斛影响的后续研究提供技术支持。液相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相为1%乙酸水溶液(A)/甲醇(C),流速:0.20 mL/min,柱温35℃;进样量为5.0μL。梯度洗脱条件为起始0%A;0~3 min,80%A;3~8 min,80%A;8~10 min,95%A。定量波长为283 nm。两种物质在10 min内完全分离。正交试验研究表明用纯水提取,料液比1:40,提取1 h(每0.5 h震荡一次),两种物质提取率最高。采用以上方法测定四个昼夜温差处理的原球茎样品,结果表明,最利于松柏苷积累的温差是25/21℃,处理15 d,松柏苷含量最高为204.78mg/kg,是对照的1.33倍。最利于紫丁香苷积累的温差是25/17℃,处理10 d,紫丁香苷含量最高为27.04 mg/kg,是对照的2.02倍。昼夜温差影响铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量,温差适当起促进作用,温差过大则抑制。3铁皮石斛DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因克隆及生物信息学分析本研究以铁皮石斛原球茎为材料,采用PCR技术对DcF5H、DcCOMT、DcCAD进行全长克隆。结果表明:DcF5H的ORF长1 536bp,编码511个氨基酸,亚细胞定位预测其定位于细胞基质。DcF5H有细胞色素P450蛋白保守结构域,属于氧化酶系蛋白。DcCOMT的ORF长1 086 bp,编码361个氨基酸,亚细胞定位预测DcCOMT位于细胞质,DcCOMT有7个保守结构域,这些保守结构域可能具有甲基转移的功能。DcCAD的ORF长641 bp,编码216个氨基酸,亚细胞定位预测DcCAD位于线粒体,含有典型的乙醇脱氢酶保守结构域和NAD(P)结合保守结构域,可以推测该蛋白质具有还原酶的特性。进一步对DcCOMT密码子偏好性进行分析。结果显示,铁皮石斛DcCOMT的ENC值、GC含量以及GC3分别为49、0.452和0.396,表明其密码子偏好性较弱,偏好使用A或T结尾的密码子;突变压力是DcCOMT密码子偏好性形成的主要作用力;铁皮石斛DcCOMT基因和同为兰科植物的香味蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina)亲缘关系最近,两者的GC1s、GC2s、GC3s、GC、CAI和ENC也较为相近,表明物种进化关系上越相近其密码子偏好性也较为相似。此外,从密码子使用频率分析得出酵母菌真核表达系统适合铁皮石斛DcCOMT基因的异源表达,模式植物烟草、番茄可以作为其遗传转化受体。获得铁皮石斛DcCAD基因启动子序列。扩增得到该基因的启动子序列2 003 bp,DcCAD的启动子分析表明:该基因转录起始区域位于-147~-197,转录起始位点为位于-156 bp的G,该启动子含有多个光响应元件、激素应答元件、生长与代谢调控元件以及昼夜调控相关的元件,推测DcCAD可能参与铁皮石斛体内多种激素信号转导、防卫反应及其他生长代谢过程。4铁皮石斛DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因的定量表达分析在25/25℃、25/21℃、25/17℃、25/13℃处理下的DcF5H、DcCOMT、DcCAD基因的表达模式。结果表明,DcF5H和DcCOMT表达量与紫丁香苷含量呈现显著负相关,可以推测DcF5H、DcCOMT具有相似的调控模式,对松柏苷和紫丁香苷的代谢具有负调控作用。DcCAD表达量和紫丁香苷含量呈现显著正相关关系,推测DcCAD与DcF5H、DcCOMT具有相反的调控模式。以上表明DcF5H、DcCOMT负调控松柏苷和紫丁香苷生成;DcCAD表达量升高导致铁皮石斛松柏苷和紫丁香苷含量升高。