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莫荷罗非鱼“广福1号”为莫桑比克罗非鱼与荷那龙罗非鱼的杂交种,与亲本相比,在盐碱胁迫调控方面具有明显的杂种优势。本研究在转录组测序的基础上分析了莫荷罗非鱼鳃组织中miRNA与mRNA表达谱,并从中筛选出显著差异表达的miRNA-mRNA对,分析其在碱胁迫下莫荷罗非鱼及杂交亲本中的表达特征,初步了解所筛选出的差异表达的miRNA-mRNA对在碱胁迫下的调控功能。本研究结果为罗非鱼碱胁迫下的miRNA及mRNA的表达调控机制以及罗非鱼耐盐碱分子遗传机理的研究提供了重要的研究资料。1.碱胁迫下莫荷罗非鱼miRNA文库构建及生物信息学分析以莫荷罗非鱼为研究对象,取碱胁迫(浓度为4 g/L)24 h的莫荷罗非鱼鳃组织(碱度0%为对照组)进行miRNA转录组测序,实验设三个重复(A4、A5、A6),每个重复为6尾鱼。构建碱胁迫下莫荷罗非鱼鳃组织miRNA表达谱文库,并利用生物信息学的手段分析测序结果。结果显示:在A4、A5、A6中分别发现180、185、186个已知miRNA,790、392、515个新miRNA;与对照组相比,在碱处理组中共筛选出41个显著上调的miRNA,42个显著下调的miRNA;对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测,并将预测结果进行GO与KEGG富集分析,发现MAPK信号通路(ko04010)、矿物质吸收(ko04978)、mTOR信号通路(ko04150)、TCA循环(ko00020)以及脂肪酸生物合成(ko00061)等57条通路被富集到。从83个显著差异表达的miRNA中随机挑选18个进行qPCR验证,结果与转录组测序结果一致,说明该测序结果能够用于后续实验的操作。本实验在碱胁迫下的莫荷罗非鱼鳃组织的miRNA表达谱中发现了大量差异性表达的miRNA及靶基因和渗透压调控通路,为硬骨鱼类渗透压调控机制的研究提供研究资料。2.碱胁迫下莫荷罗非鱼mRNA表达谱构建及生物信息学分析以莫荷罗非鱼为研究对象,取碱处理(浓度为4 g/L)24 h下的莫荷罗非鱼鳃组织(碱度0%为对照组)进行mRNA表达谱及测序,实验设置三个重复(A4、A5、A6),每个重复6尾鱼。利用生物信息学的手段对碱处理下莫荷罗非鱼鳃组织mRNA文库的测序结果进行分析。结果显示:与对照组相比,碱处理组中共筛选出3412个显著差异表达的基因,其中1472个上调,1940个下调;GO分析共富集到35个GO项目;KEGG富集分析发现近端小管碳酸氢盐重吸收(ko04964)、TNF信号通路(ko04668)以及类固醇生物合成途径(ko00100)等51条信号通路。从显著性差异表达的基因中随机挑选出16个基因进行qPCR验证,结果与转录组测序结果一致,说明本实验结果能够用于后续实验的研究。本实验中,莫荷罗非鱼在碱胁迫下,鳃组织的mRNA表达谱中存在大量差异性表达的基因,其中有部分基因为具有渗透压调控功能的基因,此项研究为系统地研究渗透压胁迫下发挥调控功能的基因及通路提供基础资料。3.碱胁迫下莫荷罗非鱼及亲本差异性表达的miRNA及靶基因表达分析整合分析碱处理下的miRNA及mRNA测序结果,共发现185对显著差异表达的miRNA-mRNA,从中挑选出四对miRNA-mRNA并分析其在三种罗非鱼鳃、肠、肝、中肾、肌肉中的表达特征。分析结果显示:miRNA-1824-atic,miRNA-356-cant1,miRNA-766-pparα和miRNA-1352-sdpt1-a在莫荷罗非鱼及其亲本鳃、肠、肝、中肾、肌肉等五种组织中均有表达,且miRNA的表达趋势与靶基因相反;通过比较分析miRNA及其靶基因在莫荷罗非鱼及其亲本中的表达特征,表明miRNA-1824-atic,miRNA-356-cant1,miRNA-766-pparα,miRNA-1352-sdpt1-a可能在罗非鱼的渗透压调节中发挥重要的作用。