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二硫化碳(carbon disulfide,CS2)是工业上常用的有机溶剂,广泛应用于农药、纺织、橡胶等多个行业。职业接触人群较多,主要通过呼吸系统对人体产生损伤。已有研究表明CS2对消化系统、神经系统、免疫系统、心血管系统等多个系统均具有损害作用。长期低浓度CS2暴露对雄性生殖系统亦有毒性作用,但其机制仍不清楚。 一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种简单的自由基气体物质,具有第二信使、神经递质和效应分子等多种生理功能。生物体内,L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下生成L-瓜氨酸及NO,其中NOS是NO合成最主要的限速酶[1]。NOS有以下几种形式:神经型NOS(neuronal nitricoxidesynthase,nNOS)、诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、内皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)。邓菁等研究发现CS2可造成睾丸组织氧化损伤,睾丸组织中NO含量、总NOS(tNOS)活力及iNOS活力下降[2]。因而推测,CS2可能通过影响下丘脑垂体性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonad axis,HPGA)中NOS活力来影响NO生成,从而引起生殖功能紊乱。目前,国内外关于CS2对雄性HPGA影响的研究较少,其机制尚不明确。该研究以CS2作为受试物,体外培养下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞,探讨CS2对以上三种细胞中NO及NOS影响,并添加NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside,SNP)和总NOS抑制剂N-甲基-L-精氨酸(NG-Monomethyl-L-arginine,L-NMMA)进行干预,为进一步阐明CS2对雄性生殖损伤的机制提供科学依据。 第一部分：雄性大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞体外培养鉴别及CS2染毒对三种细胞存活率的影响 目的:探讨大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞体外培养技术,以及不同浓度CS2染毒对三种细胞存活率的影响。 方法:选用出生1d的雄性SD大鼠,取下丘脑组织体外培养,动态观察下丘脑神经元体外生长情况,并用尼氏染色进行鉴定;选用180g左右的成年雄性SD大鼠取垂体前叶进行体外培养,动态观察垂体前叶细胞体外生长情况,并用免疫细胞化学染色法对LH和FSH分泌细胞进行鉴定;选择18d左右的雄性SD大鼠取睾丸组织进行体外培养,动态观察细胞体外生长情况,并用feulgen染色法对支持细胞进行鉴定;对离体培养的三种细胞经不同浓度的CS2染毒24h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其在490nm的吸光度值。 结果:显微镜下观察:下丘脑神经元培养3d时可见双极突起,突起较短;培养7d时突起长度达最长;尼氏染色可见胞质内有颗粒状的尼氏体,呈深蓝色。垂体前叶细胞0h时呈圆形,2d后观察呈不规则形,成纤维细胞生长迅速,培养后期成纤维细胞多见;免疫细胞化学染色可见,LH和FSH免疫阳性细胞包浆呈棕黄色。支持细胞贴壁迅速,72h后胞质铺展,细胞间相互连接;feulgen染色支持细胞形状不规则胞体较大,胞核呈椭圆形。在下丘脑神经元中,当CS2染毒浓度升高,细胞存活率下降,当CS2染毒浓度达到8μmol/ml时,下丘脑神经元存活率明显降低(P<0.05);在垂体前叶细胞中,当CS2染毒浓度升高,细胞存活率下降,当CS2染毒浓度达到6μmol/ml时,垂体前叶细胞存活率明显降低(P<0.05);在睾丸支持细胞中,当CS2染毒浓度升高,细胞存活率下降,当CS2染毒浓度达到3μmol/ml时,支持细胞存活率明显降低(P<0.05)。结论:本实验室采用的大鼠下丘脑神经元体外培养方法能为进一步研究提供理想的体外实验模型;垂体前叶细胞中可见有多种细胞,LH和FSH免疫反应阳性细胞所占比例较低;支持细胞中存在有少量的精原细胞,其细胞纯度达到体外实验模型标准。CS2对体外培养的下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞具有细胞毒作用,细胞存活率下降。 第二部分：不同浓度CS2染毒对大鼠下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞中NO/NOS及mRNA水平影响及NO干预作用。 目的:检测CS2染毒下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞中NO含量,NOS活性及mRNA表达的变化,以及外源性NO干预作用 方法:下丘脑神经元和垂体前叶细胞细胞染毒组,设0.05％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)为对照组,低、中、高剂量组为2.50、5.00、10.00μmol/mlCS2,SNP组为10.00μmol/mlCS2+20μmol/mlNO供体SNP,L-NMMA组:10.00μmol/mlCS2+50μmol/mlNOS抑制剂L-NMMA;睾丸支持细胞染毒组设0.05%(v/v)DMSO为对照组,设低、中、高剂量为1.25、2.50、5.00μmol/mlCS2,SNP组为5.00μmol/mlCS2+10μmol/mlNO供体SNP,L-NMMA组为5.00μmol/mlCS2+25μmol/mlNOS抑制剂L-NMMA。采用NO及NOS试剂盒检测不同浓度CS2染毒及外源性NO干预作用下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞中NO及NOS变化;采用Realtime-PCR方法检测不同浓度CS2染毒条件下丘脑神经元、垂体前叶细胞、睾丸支持细胞中nNOS、iNOS、eNOS的mRNA表达影响。 结果:CS2可引起下丘脑神经元中NO的含量升高(P<0.05),tNOS和iNOS活力亦升高(P<0.05),加入外源性SNP后,NO含量显著增加(P<0.01),高剂量组的iNOS的mRNA表达亦升高(P<0.05),而对eNOS和nNOS的mRNA影响不明显(P>0.05)。CS2引起垂体前叶细胞中NO含量及NOS活力升高(P<0.05),加入外源性SNP后,NO含量显著增加(P<0.01),L-NMMA组总一氧化氮合酶(tNOS)活力下降(P<0.05),且高剂量组iNOSmRNA表达升高(P<0.05)。CS2可引起支持细胞中NO含量显著下降(P<0.01),加入外源性SNP后,NO含量显著增加(P<0.05)。其中NOS活力均下降,NOSmRNA表达无统计学意义(P>0.05)。 结论:CS2染毒可降低下丘脑神经元、垂体前叶细胞、支持细胞存活率,并引起NO生成异常。