水稻迟穗突变体dh的分子鉴定与分析

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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,而抽穗时间和种子大小作为水稻生育期中最重要的农艺性状,对水稻的高产稳产具有重要的作用。我们从本实验室构建的水稻T-DNA插入突变体材料中获得了一个推迟抽穗且种子长度明显变短的迟穗(delayed heading,dh)突变体。dh突变体的主要表型为推迟抽穗、植株明显增高、分蘖增多、谷粒变短、千粒重减少、伸长节增多。通过TAIL-PCR鉴定发现dh突变体中T-DNA插在OsATG8b的3UTR上,距离pri-osa-miR171c转录起始位点2424 bp,使得OsATG8b不能形成正常的转录本,同时pri-osa-miR171c的表达被明显上调。OsATG8b的遗传互补实验证明了谷粒变短、千粒重减少的表型是由OsATG8b基因控制的;而推迟抽穗、植株明显增高、分蘖增多、伸长节增多的表型是由pri-osa-miR171c上调引起的。  miRNA是一类长度为20~24nt的、广泛存在于真核生物中的内源性非编码小RNA,在进化上高度保守,它主要是通过直接切割靶基因和间接抑制靶基因翻译两种方式在转录后水平调控基因的表达。miRNA在植物的生长发育中起着非常重要的调节作用,涉及到植物器官发育、信号转导、自身合成调节、生物胁迫与非生物胁迫等许多方面。水稻miR171家族有11个成员,其中osa-miR-171b~f、m和n这7个成员的成熟序列是完全一样的。在dh突变体中,osa-miR171c-3p作为osa-miR171c的主要成熟产物,在叶、茎尖以及穗等器官中被显著上调。RLM-5RACE实验表明OsHAM1、OsHAM2、Os HA M3、OsHAM4是osa-miR171c的靶基因,且它们在dh突变体中的表达被明显下调。OsHAMs属于转录因子GRAS家族中的成员,主要定位在细胞核中。定量PCR结果表明:osa-miR171c及其靶基因的表达呈现高度负相关,osa-miR171c在起始开花前的茎尖中低表达而在穗发育的过程中表达量逐渐升高;相反,OsHAMs则在成年期的茎尖中高表达,在转变到生殖生长阶段后表达量则急剧下降。同时,两者在冷胁迫下的表达也呈现一定程度的负相关。osa-miR171c和OsHAMs的表达主要是受到光的直接调节,且这种调节独立于内源生物钟的调节。osa-miR171c表达的上调会产生多向性的表型,在营养生长阶段,osa-miR171c通过间接调节miR156的表达来影响水稻从幼年期向成年期的转变。在成年期的后期阶段,osa-miR171c可能通过影响OsPHYC的表达来参与调节开花的另外一条途径,最后通过影响成花素Hd3a和RFT1的表达来调控开花的时间。除此之外,osa-miR171c可以通过影响其靶基因OsHAMs的表达来调节茎尖生长点干细胞属性决定基因OsFON4的表达,进而影响生长点向花序分生组织的转变。在生殖生长阶段,osa-miR171c表达的上调会使茎秆变粗,一次枝梗数目增加。  自噬是真核生物中对细胞内物质进行循环利用的一个保守的蛋白降解途径。它在植物生长发育,应对逆境胁迫等多种生命活动中都扮演着重要的角色。OsATG8b蛋白具有一个LC3的功能域,与酵母ATG8的氨基酸序列具有较高的同源性,在空间结构上,OsATG8b也具有和酵母ATG8相似的W区和L区以结合其特异的底物,说明他们可能具有共同的结合蛋白且发挥相似的功能。酵母互补实验证明了OsATG8b可以恢复酵母atg8突变体的表型,能够运输氨肽酶的前体进入液泡,且在酵母中能够发挥正常的功能,这些都说明OsATG8b具有和酵母ATG8相同的自噬功能。在水稻中,OsATG8b缺失后在水稻细胞中观察不到自噬体的存在,这说明OsATG8b是水稻细胞中自噬体形成所必需的。和ZH11相比,dh表现出在苗期生长缓慢的表型,这种差异在营养缺乏的情况下表现的尤为明显,表明OsATG8b会影响水稻幼苗生长。GUS染色实验和RT-PCR实验结果表明OsATG8b是一个组成型表达的基因,在胚乳发育后期高表达,同时节律分析表明它在夜间表达量增加,所以我们推测OsATG8b可能通过降解叶片中的淀粉参与了种子的灌浆过程。  对osa-miR171c和OsATG8b在逆境下的表达分析可知,osa-miR171c主要能够对干旱和盐胁迫做出响应,对冷的响应主要是在根中,对暗处理则基本无响应;OsATG8b对逆境的响应主要集中在叶里,主要是对干旱和暗处理有响应,在根中对任何逆境基本都无响应。我们对ZH11和dh在胁迫处理下的表型分析表明,在盐胁迫下,dh表现出了明显的耐受性差的表型。突变掉OsATG8b的水稻植株与对照相比对饥饿更加敏感。
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