病毒入侵是病毒感染宿主细胞的第一步,这个过程涉及病毒与细胞受体的结合、膜融合等步骤,这些步骤是由病毒的膜蛋白介导。杆状病毒中已知存在三种不同类型的膜蛋白:有融合活性的GP64(α属组Ⅰ nucleopolyhedrovirus(NPV))和F蛋白(α属组ⅡNPV及β、δ属杆状病毒),以及融合功能退化的F-like蛋白(α属组INPV)。进化假说推测F是杆状病毒的祖先膜融合蛋白,而GP64则被认为是在进化晚期才被组Ⅰ NPV捕获,使F蛋白丧失了融合活性,退化为F-like蛋白。我们实验室前期对GP64和F蛋白的功能进行了深入研究,并且通过构建一系列模拟杆状病毒进化不同节点的假型病毒,佐证了杆状病毒膜蛋白的进化假说(Wang et al,unpublished data)。　　 传统的观点认为,杆状病毒通过内吞途径感染宿主细胞。我们实验室的前期研究发现,α属组Ⅰ Autographa californica multicapsid(AcM)NPV(GP64膜融合蛋白)可以利用直接膜融合方式高效入侵昆虫和哺乳动物细胞[1]。本论文研究中,我们进一步对α属组Ⅱ NPV以及含有不同GP64和F蛋白组合的一系列假型病毒的入侵途径进行了深入研究。结果发现,ⅰ)不同的膜融合蛋白和靶细胞类型的组合决定了杆状病毒入侵途径,即通过膜蛋白的修饰可以改变病毒的入侵途径;ⅱ)发现在宿主的适应性进化历程中,祖先杆状病毒捕获GP64并使F蛋白退化为无活性的。F-like蛋白使得组Ⅰ NPV获得了新的直接膜融合入侵途径,即膜蛋白的功能演化是促进杆状病毒入侵机制进化的关键因素之一。　　 第一章:文献综述。详细介绍病毒入侵宿主细胞的几种主要途径,病毒膜融合蛋白的分类及细胞受体的研究进展。对杆状病毒的分类及应用作简要说明,对杆状病毒三类膜蛋白GP64、F及F-like蛋白的功能进行了综述,并对杆状病毒入侵宿主细胞的过程进行了介绍。最后介绍了本论文的研究目的和意义。　　 第二章:杆状病毒膜蛋白的功能与病毒入侵途径的关系研究。本章中,我们以前期构建的一系列不同GP64和F蛋白组合的假型病毒为研究对象,系统地研究了膜融合蛋白与杆状病毒入侵途径之间的关系。结果发现,含有F蛋白的组Ⅱ Helicoverpa armigera(Hear)NPV不能通过直接膜融合途径有效感染HzAM1细胞;但F蛋白却可以有效介导组ⅠAcMNPV利用直接膜融合方式入侵Sf9细胞。这提示不同的细胞类型(细胞膜组成)可能影响了病毒的入侵途径。HearNPV通过两种途径入侵HzAM1细胞都依赖于细胞骨架蛋白actin,且入侵速率相当。考虑到GP64具有比F蛋白更强大的膜融合活性,或许可以更有效地介导HearNPV与HzAM1细胞质膜的直接融合,我们对共表达GP64和F蛋白的假型病毒vHaBac-gp64进行了研究(该病毒模拟了GP64入侵祖先杆状病毒,与F蛋白并存的进化节点)。然而,GP64也无法帮助HearNPV通过直接膜融合途径有效入侵HzAM1细胞。进一步研究发现,共表达GP64和丧失融合活性的HaFaef的假型病毒vHaBacAF-HaFdef-gp64(模拟GP64入侵后使F蛋白的Furin位点突变,退化为F-like蛋白的进化节点)可以利用内吞和直接膜融合两种途径高效入侵昆虫细胞。这提示有融合活性的F蛋白的存在干扰了GP64的功能。因此,我们推测杆状病毒膜融合蛋白的功能演化促使病毒发展了新的入侵机制。　　 以GP64作为膜融合蛋白的AcMNPV可以转导多种哺乳动物细胞系,且通过直接融合方式入侵哺乳动物细胞的效率比同等条件下的内吞途径提高数十倍。本章中构建了3种带有哺乳动物细胞/昆虫细胞双启动子的绿色荧光蛋白(pCMV-pOP166-egfp,简称CG)标记的重组HearNPVs:vHaBac-CG(F),vHaBac-gp64-CG(F+GP64)与vHaBac△F-HaFdef-gp64-CG(HaFdef+GP64)。结果发现,vHaBac-CG无法转导哺乳动物和鲤鱼上皮癌细胞,而表达GP64两种假型病毒vHaBac-gp64-CG和vHaBac△F-HaFdef-gp64-CG无论是通过内吞还是直接膜融合方式都只能非常低效地转导哺乳动物和鲤鱼上皮癌细胞。这提示除了第一步的入侵效率之外,AcMNPV基因组中可能存在哺乳动物细胞复制和转录所需的独特基因。　　 第三章:GP64及F蛋白的表达。本章对AcMNPV、Bombyx mori/(Bm)NPV的GP64和HearNPV的F蛋白进行了原核和真核表达及条件优化。在原核表达系统中,我们分别构建了带有组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)的BmGP64的表达载体,重组蛋白得到大量表达且可溶性较好;我们还构建了表达AcGP64和BmGP64的重组杆状病毒,在Sf9细胞中这两种蛋白也得到了部分可溶表达。为了获得稳定、均一的HaF蛋白,我们突变了Furin剪切位点、并在此基础上对形成亚基间二硫键的半胱氨酸位点CI08,以及1个重要糖基化位点的N104进行突变,构建成两种重组杆状病毒,发现突变型的HaF在Sf9细胞和NT细胞中均能可溶表达,并在Sf9细胞中检测到目的蛋白被糖基化修饰。下一步我们将进行大规模的表达和蛋白纯化,以期为更加深入地解析杆状病毒膜融合蛋白结构和功能奠定基础。