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帕金森病(Parkinsonsdisease,PD)是中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,临床症状主要表现为静止性震颤、肌肉强直和运动迟缓等。其主要病理特征为黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性变性、死亡。目前PD的病因尚不清楚,最近研究表明,体内雌激素水平与PD发病相关,并且小胶质细胞激活在PD病程中有重要作用。鸡豆黄素A(BiochA)是鹰嘴豆中一种重要的异黄酮,其作为一种植物雌激素,发挥着多种生物学功能,但是它在神经退行性疾病的中的作用尚不明确。 目的:观察BiochA对小胶质细胞激活介导的多巴胺能神经元损伤的保护作用及相关的机制。 方法:采用MTT法,检测脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和Bioch A对原代培养的小胶质细胞和BV-2细胞的毒性作用,筛选LPS的刺激剂量和Bioch A的剂量；在原代培养的小胶质细胞和BV-2细胞中, Bioch A(5μM)预处理 30min后分别加入1μg/ml LPS和10μg/ml LPS共同孵育36h,采用 OX42染色观察小胶质细胞的形态变化；采用ELISA检测法、Griess法和DCFH-DA 探针法分别检测原代培养小胶质细胞上清液中肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白介素-1β(interleukin 1β,L-1β)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化；采用RT-PCR法、Western Blot法分别检测BV-2 细胞内 TNF-a、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的基因表达变化和iNOS,环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),p-JNK,p-ERK的表达变化；建立大鼠原代中脑小胶质细胞—神经元混合培养体系,给予Bioch A (1.25,2.5,5μM)预处理30min后用LPS(10μg/ml)刺激,采用OX-42免疫组织化学染色观察小胶质细胞的形态变化；采用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色,观察多巴胺能神经元形态和数量变化,分析小胶质细胞活化与多巴胺能神经元退变丢失的关系。 结果: 1.原代培养小胶质细胞经LPS刺激激活后,形态发生显著变化:胞体变大,形态不规则,胞身有很多短小的突起,类似阿米巴状;BV-2细胞经LPS刺激后两端的轴突消失变成短小的突起,胞体变大。 2.BiochA(2.5,5μM)减少了活化的小胶质细胞的数量、降低了细胞上清液中TNF-a,IL-1β,NO的含量以及细胞内ROS的含量。 3.LPS诱导BV-2细胞激活后,细胞内TNF-amRNA,IL-1βmRNA和iNOSmRNA的表达显著上调,iNOS,COX-2蛋白表达增多;BiochA(5μM)预处理30min后,抑制TNF-amRNA,IL-1βmRNA和iNOSmRNA表达以及COX-2和iNOS蛋白表达,以上结果表明BiochA可以在转录水平和蛋白水平抑制炎症介质的产生。 4.BiochA(2.5,5μM)抑制p-JNK和p-ERK蛋白的表达,提示BiochA抑制炎症因子的释放可能是通过抑制ERK和JNK这一信号转导通路来实现的。 5.在大鼠原代小胶质细胞—多巴胺能神经元的混合培养体系中,LPS(10μg/ml)作用2天后,小胶质细胞明显被激活,多巴胺能神经元数量显著减少,残存的多巴胺能神经元突起减少、变短或断裂。而BiochA(1.25,2.5,5μM)预处理30min后,小胶质细胞激活被抑制,多巴胺能神经元的存活数量显著提高,提示BiochA保护多巴胺能神经元可能与抑制小胶质细胞激活有关。 结论:BiochA抑制了LPS诱导的小胶质细胞的激活,减少炎症介质的释放,降低p-JNK和p-ERK蛋白的表达,对LPS诱导的DA神经元损伤具有保护作用。