ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种由25-35个L-赖氨酸(L-lysine,L-Lys)单体通过α-羧基及ε-氨基形成的酰胺键连接而成的同型氨基酸聚合物,主要由链霉菌属微生物经好氧发酵产生并在胞外积累。由于ε-PL具有广泛的抑菌谱和较高的安全性,目前它被用作一种新型生物食品防腐剂,在日本、韩国、美国和中国的食品工业中获得批准使用。此外,ε-PL作为一种安全且环境友好的生物聚合物,在生物医药领域也有着广泛应用前景。因此,ε-PL是一种具有广泛应用领域和巨大市场价值的新型生物技术产品。本论文以一株ε-PL高产菌Streptomyces albulus M-Z18(S.albulus M-Z18)为研究对象,通过分析葡萄糖、甘油及葡萄糖-甘油双碳源发酵中的细胞生理参数、基因转录及代谢通量差异,解析双碳源强化ε-PL分批发酵的机制;通过基因转录分析和辅助碳源添加实验探讨S.albulus M-Z18同步利用葡萄糖和甘油的生理基础;最后,从氧化胁迫角度,系统分析双碳源补料分批发酵中后期发酵性能衰退的原因。取得的主要研究结果如下:(1)通过监测ε-PL合成代谢中关键酶活性,发现双碳源发酵中磷酸戊糖(PPP)途径关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性在31 h分别为葡萄糖和甘油的1.6和1.9倍,有助于L-Lys合成及细胞生长;此外,糖酵解(EMP)途径及三羧酸(TCA)循环关键酶丙酮酸激酶(PK)与柠檬酸合成酶(CS)活性均为单一碳源的2倍,有效促进了NADH的合成;另外,双碳源中回补途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与丙酮酸羧化酶(PYC)活性均为单一碳源中的1.5倍以上,同时二氨基庚二酸(DAP)途径关键酶天冬氨酸激酶(ASK)活性在21h分别为葡萄糖及甘油的6.4及1.3倍,故能够促进前体L-Lys的合成;除此之外,双碳源中ε-PL合成酶(Pls)活性还是单一葡萄糖发酵的2倍,从而直接强化ε-PL的合成;通过监测并分析不同碳源发酵的尾气组成以及胞内能量辅因子水平,确定双碳源发酵中细胞还具有更强的呼吸代谢及合成NADH、ATP的能力。因此,葡萄糖-甘油双碳源主要通过增强ε-PL合成途径中关键酶活性和细胞呼吸能力来强化ε-PL的合成。(2)双碳源发酵中的ε-PL合成强化伴随着菌体的快速生长,而其中ε-PL快速合成的原因是碳源本身还是细胞快速生长的状态仍不得而知。借助恒化培养技术,考察不同稀释率(0.02、0.04、0.05、0.06、0.08 h-1)对ε-PL合成的影响,发现细胞比生长速率与ε-PL比合成速率在0.02-0.06 h-1稀释率范围内呈正相关关系。通过比较不同稀释率下细胞的生理状态,发现生长更快的细胞(0.06 h-1)具备更高CS和PEPC活性、胞内L-天冬氨酸(L-Asp)与L-Lys水平、NADH利用效率与能荷水平以及抗氧化胁迫的能力,从而为ε-PL合成提供更多ATP及L-Lys;通过对同一稀释率(0.05 h-1)不同碳源发酵中细胞内碳代谢流进行分析比对,发现双碳源发酵中细胞在EMP途径、TCA循环、回补途径和DAP途径上具有更高的代谢通量,从而为ε-PL合成提供了充足的L-Lys前体。因此,双碳源发酵中ε-PL合成强化效应来自于碳源本身和细胞快速生长这两方面。(3)借助转录组技术,通过比较和分析双碳源与单一碳源发酵中涉及的ε-PL合成代谢相关基因的转录水平,发现在涉及5-磷酸核糖、碱基、细胞壁合成、DNA复制以及核糖体亚基合成方面,双碳源相对单一碳源发酵其基因转录获得了1.5倍以上的提升,有利于细胞生长;同时发现,双碳源能够强化TCA循环、回补途径以及DAP途径中基因的转录,从而增强前体L-Lys合成及其碳骨架供给能力;此外,双碳源还显著强化了氧化还原酶、细胞色素、F-型H+-ATP合成酶以及能量辅因子合成相关基因的转录(其中2倍以上转录上调基因超过50%),从而大幅增强了ATP的合成能力。然而,双碳源在pls及pld上并未表现出明显强化。因此,双碳源主要是通过增强前体及能量的合成代谢来保障ε-PL快速合成的。(4)利用转录组技术,通过比较分析双碳源与葡萄糖、甘油发酵中碳源利用相关基因的转录,发现葡萄糖的利用不会抑制甘油跨膜转运及磷酸化基因的转录,成为S.albulus M-Z18同步代谢葡萄糖和甘油的前提;针对细胞的中心碳代谢,通过对不同碳源发酵中相关基因的转录进行分析,发现葡萄糖或甘油发酵中细胞潜在需要另一种碳源参与代谢,而双碳源恰好能满足这种需求;通过辅助碳源的添加,进一步证实了这种需求的存在;双碳源的同步利用能为细胞生长及ε-PL合成提供大量前体及能量,表现为细胞生长及ε-PL合成强化双重效应。因此,S.albulus M-Z18同步代谢葡萄糖和甘油的生理基础是双碳源的同步利用未受到分解代谢物阻遏效应影响,且能够充分满足细胞对碳骨架的需求。(5)通过对葡萄糖、甘油及双碳源补料发酵参数进行系统分析,发现双碳源补料发酵中细胞代谢能力在36 h后快速衰退;通过监测发酵过程中细胞生理状态,发现细胞活力、G6PDH活性、胞内ATP水平及前体L-Lys水平在36 h后均快速下降;通过测定过程中活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)、氧化损伤水平,发现双碳源发酵前期高强度呼吸代谢产生了大量ROS导致氧化损伤,造成电子传递链(Electron transport chain,ETS)活性下降而引起ATP的供应不足;转录组学分析发现,双碳源中更强的氧化胁迫环境诱导了抗氧化酶系及损伤修复相关基因发生大量转录(1.5倍以上转录上调);然而,通过监测补料过程中胞内的抗氧化酶活性,发现双碳源发酵中抗氧化酶系活力极低,从而使得细胞无法对抗氧化胁迫。因此,双碳源补料发酵前期细胞高强度呼吸代谢产出大量ROS,破坏了细胞的正常生理状态,这可能造成中后期细胞的代谢性能快速衰退。