尼罗罗非鱼是一种性别分化方向受到基因和温度同时调控的鱼类,即在尼罗罗非鱼的性别分化期,温度能够对其性别分化的方向起到一定的导向作用,而温度是如何影响其性别分化的,具体的分子机制是什么,目前还不是很清楚。Cyp19a1a基因,编码的芳香化酶,是雄激素转变为雌激素的限速酶,在尼罗罗非鱼性别分化期起关键性作用,它能够决定尼罗罗非鱼的性别分化的方向。表观遗传学是近年来研究的热点,一些表观遗传机制如DNA甲基化和组蛋白甲基化都能影响基因的表达,甚至能够影响鱼类的性别分化方向。表观遗传机制是如何介导尼罗罗非鱼的性别分化过程和相关基因的表达的,而高温诱导又在其中扮演了什么角色,这是一个有待研究的问题。本研究中,对进入热敏期的尼罗罗非鱼幼鱼进行36℃高温诱导,诱导12天后养至4月龄采样,分别提取对照雌鱼CF、对照雄鱼CM、诱导雌鱼IF、诱导雌鱼IM的DNA后进行MeDIP-seq高通量测序,研究高温诱导对尼罗罗非鱼全基因组甲基化水平的影响。鉴于cyp19a1a在罗非鱼性别分化中的重要作用,本文分析了高温诱导对罗非鱼cyp19a1a基因启动子区甲基化水平和mRNA表达水平的影响,并采用ChIP分析了高温诱导对组蛋白甲基化水平的影响。同时,亚硫酸氢盐测序(BSP)检测不同年龄段罗非鱼cyp19a1a基因启动子区甲基化水平和qRT-PCR技术分析相应的mRNA表达量变化。主要结果如下:采用MeDIP-seq技术,对高温组和对照组的雌雄尼罗罗非鱼的全基因组甲基化水平进行测序分析,4个组(对照雌鱼CF、对照雄鱼CM、诱导雌鱼IF、诱导雄鱼IM)分别获得100 bp大小长度的128055474、50323361、69696162、75132883个raw data,四个组共含有16.15Gb的raw reads;其中含有105101871、47468675、55024475、67759606个clean data,分别占raw data的82.08%、92.33%、78.95%、90.19%,共13.75Gb。四个组分别有105101871、47468675、55024475、67759606个reads比对到尼罗罗非鱼的全基因组上,其中有49917355、22480291、26099799、32506902个特异reads,占所有比对到基因组上reads的47.49%、47.36%、47.43%、47.97%。四组间两两比较,各比较组甲基化水平上下调基因数分别为:CF/CM上调基因344个,下调基因661个;IF/IM上调基因331个,下调基因215个;IF/CF上调基因248个,下调基因126个;IM/CM上调基因568个,下调基因680个。并从这些基因中筛选出了四个性别分化相关基因采用qRT-PCR验证其m RNA表达量,结果显示这些基因mRNA表达量的变化趋势与甲基化水平的变化相符合。总体来讲,MeDIP-seq结果显示高温诱导能够一定程度上影响尼罗罗非鱼全基因组甲基化水平。亚硫酸氢盐测序结果显示,经高温诱导后,雌雄尼罗罗非鱼cyp19a1a基因启动子区甲基化水平都有所上升,并且该基因的mRNA表达量也显著下降,高温组和对照组间均差异显著(P<0.05),这说明高温诱导能够显著升高雌雄尼罗罗非鱼cyp19a1a启动子区的甲基化水平,降低其表达量。染色质免疫共沉淀(ChIP)检测了高温诱导对尼罗罗非鱼cyp19a1a基因组蛋白H3K9的甲基化水平的影响,结果显示,高温诱导能显著升高雄性尼罗罗非鱼组蛋白H3K9的甲基化水平,并且募集到的RNA聚合酶的量显著下降,暗示了高温诱导能通过影响组蛋白甲基化显著降低雄性尼罗罗非鱼cyp19a1a基因的转录程度。亚硫酸氢盐测序结果显示雌性尼罗罗非鱼随着年龄的增长,cyp19a1a基因启动子区甲基化程度逐渐下降,qRT-PCR结果显示该基因的mRNA表达量逐渐上升;而雄鱼的甲基化程度则是呈现上升趋势,mRNA表达量逐渐下降。各年龄段间甲基化水平和mRNA表达量均差异显著(P<0.05)。表明随着年龄的增长,雌性尼罗罗非鱼对cyp19a1a表达产物芳香化酶的需求量逐渐上升,而雄鱼的则呈下降趋势。总之,本研究结果显示了高温诱导能够显著的影响尼罗罗非鱼的全基因组甲基化水平,并能够增加cyp19a1a基因启动子区的甲基化水平,降低其mRNA表达量,初步证明了表观遗传机制可能在一定程度上介导了高温诱导尼罗罗非鱼雄性化的过程。本研究的结果为进一步探索高温诱导尼罗罗非鱼雄性化过程中的分子机制提供了重要的基础。