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特应性皮炎(Atopic dermatitis, AD)是一种常见的慢性瘙痒性皮肤病,在全球成人发病率1-3%,而婴幼儿发病率高达10-20%,而且在过去30年中工业化国家发病率增加了2-3倍；目前它已成为日益严重的公众健康问题[1-2]。但是,目前特应性皮炎的病因及发病机制尚不明确,现在认为遗传易感性、环境因素以及免疫因素相互作用导致特应性皮炎的发病,表观遗传作为介导环境与遗传相互作用的重要机制,为研究遗传与环境因素如何诱发AD等过敏性疾病发病提供了全新的思路和途径,表观遗传调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA等。我们研究发现AD患者CD14+单核细胞存在基因组整体DNA低甲基化,并发现AD患者单核细胞FCER1G基因启动子序列低甲基化促使Fc受体丫亚基(FcRγ)及其相关的IgE高亲和力受体(FcεRl)和C型凝集素受体(Dectin-2)异常表达[4]。同时我们发现前炎症因子GM-CSF,TSLP等活化STAT5通路募集DNA去甲基化酶TET2共同结合至单核细胞FCER1G基因启动子序列,引起该启动子DNA序列去甲基化,激活FCER1G基因转录,使Fc受体丫亚基(FcRy)及其相关的IgE高亲和力受体(FcεR1)和C型凝集素受体(Dectin-2)表达增加,GM-CSF预处理的体外诱导的单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)异常表达Dectin-2并明显增强对过敏原卵清蛋白(OVA)提呈及诱导Th2分化。因此,我们提出：前炎症因子GM-CSF,TSLP等→活化STAT5通路→募集DNA去甲基化酶TET2→引起单核细胞FCER1G基因启动子DNA序列去甲基化→单核细胞Fc受体γ亚基(FcRy)及其表面IgE高亲和力受体(FcεR1)和C型凝集素受体(Dectin-2)表达增加→促进TH2细胞分化,诱导过敏反应→特应性皮炎发病。这一假定的发病机制首先通过分析AD患者单核细胞整体基因组甲基化状态及FCER1G基因启动子DNA序列甲基化状态,Fc受体γ亚基(FcRγ)及其表面IgE高亲和力受体(FcεR1)和C型凝集素受体(Dectin-2)表达,体外补丁甲基化验证DNA甲基化调控FCER1G基因启动子转录活性；前炎症因子GM-CSF,IL-3,TSLP激活STAT5通路对CD14+单核细胞FCER1G基因启动子DNA序列甲基化状态,Fc受体Y亚基(FcRy)及其表面IgE高亲和力受体(FcεR1)和C型凝集素受体(Dectin-2)表达的影响；用免疫共沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(CHIP)验证磷酸化STAT5募集DNA去甲基化酶TET2并共同结合至单核细胞FCER1G基因启动子序列,引起该启动子DNA序列去甲基化；体外诱导异常表达Dectin-2的单核细胞来源的树突状细胞对自身CD4+T细胞活化及Th分化的影响。通过这些研究揭示了前炎症因子GM-CSF, TSLP激活STAT5/TET2通路对单核细胞FCER1G基因启动子DNA甲基化调控及其在特应性皮炎发病中的作用与分子机制,为AD的防治提供全新的表观遗传学干预途径。第一章AD患者单核细胞FCER1G启动子调控序列甲基化状态及其与FcRγ表达相关性分析目的：AD患者单核细胞FCER1G启动子调控序列甲基化状态及其与FcRγ及其相关受体Dectin-2表达相关性分析。方法：用磁珠分选法分离10例AD患者及正常对照CD14+单核细胞,提取基因组DNA,用MethylampTM整体DNA甲基化检测试剂盒检测AD与正常对照单核细胞基因组DNA整体甲基化水平,用亚硫酸盐测序法检测AD与正常对照单核细胞FCER1G启动子调控序列甲基化状态,用real-time RT-PCR和western-blot检测FcRγ表达水平,并分析两者相关性,同时用流式细胞仪检测外周血CD14+单核细胞FcRγ相关受体Dectin-2表达。结果：1.AD组单核细胞基因组DNA整体甲基化较正常对照组明显下降(36.74士10%vs55.85±20.32%,P=0.019)；AD组单核细胞FCER1G调控序列DNA甲基化水平较正常对照组明显降低(34.0%±5.0%vs46.3％士7.9%, P=0.001)；2.AD组单核细胞FcRγmRNA及蛋白水平较正常对照组明显升高(P=0.01,P<0.001),FcRγ蛋白表达水平与FCER1G调控序列DNA甲基化水平呈明显负相关性(R=-0.772,P<0.001)；3.AD组外周血单核细胞Dectin-2表达较正常对照组明显升高(P<0.001)。结论：AD组单核细胞FCER1G调控序列存在病理性DNA低甲基化,导致FcRγ及相关受体Dectin-2过度表达。第二章补丁甲基化技术构建特殊报告载体检测DNA甲基化对FCERIG基因启动子转录活性的调控目的：构建一种特殊的荧光素报告载体检测DNA甲基化对FCERIG基因启动子调控序列转录活性的调控。方法：用补丁甲基化技术构建特殊的含完全甲基化和未甲基化的FCERIG启动子调控序列的PGL-3荧光素报告载体；通过比较完全甲基化与未甲基化荧光素报告载体活性来检测DNA甲基化对FCERG基因启动子调控序列的调控活性。结果：成功构建特殊的完全甲基化与未甲基化FCERIG启动子调控序列荧光素报告载体；并检测出甲基化与未甲基化荧光素报告载体活性比为0.36±0.07：1,P<0.001。结论：FCERIG启动子调控序列是甲基化敏感位点,FCERIG基因转录受DNA甲基化调控。第三章STAT5/TET2对FCERIG基因启动子DNA甲基化及转录活性调控的分子机制目的：探讨FCERIG基因启动子DNA甲基化及转录活性调控的分子机制。方法：用磁珠分选法分离正常人CD14+单核细胞,用前炎症因子GM-CSF, TSLP处理单核细胞激活STAT5信号通路,用亚硫酸盐测序法检测处理组与对照组单核细胞FCERIG启动子调控序列甲基化状态,用流式细胞仪检测FcRy蛋白及其相关受体Dectin-2, FcεRl的表达；用免疫共沉淀(IP)验证磷酸化STAT5(pSTAT5)是否募集结合DNA去甲基化酶TET2,及染色质免疫共沉淀(CHIP)-PCR验证pSTAT5是否结合至单核细胞FCER1G基因启动子序列。结果：GM-CSF, TSLP处理单核细胞激活STAT5信号通路,使单核细胞FCER1G启动子调控序列去甲基化、FcRγ蛋白及其相关受体Dectin-2, FcεR1表达升高；免疫共沉淀证实pSTAT5募集结合DNA去甲基化酶TET2,染色质免疫共沉淀(CHIP)证实pSTAT5结合至单核细胞FCER1G基因启动子序列,引起该启动子DNA序列去甲基化。结论：前炎症因子GM-CSF, TSLP激活单核细胞pSTAT5信号通路,pSTAT5募集DNA去甲基化酶TET2,结合至FCER1G启动子调控序列,引起该启动子DNA序列去甲基化,使FcRy及其相关受体Dectin-2,FcεR1表达升高。第四章Dectin-2在MoDCs对OVA摄取提呈及诱导Th2细胞分化中的作用目的：异常表达Dectin-2的单核细胞来源的树突状细胞(MoDCs)对过敏原-卵清蛋白(OVA)提呈及T细胞Th分化的影响。方法：用磁珠分选法分离正常人CD14+单核细胞和CD4+T细胞,单核细胞用前炎症因子GM-CSF预处理3天后,再用GM-CSF+IL-4处理7天体外诱导为MoDC,用卵清蛋白(OVA)刺激与自身CD4+T细胞共孵育3天,在免疫荧光显微镜下观察MoDC Dectin-2的表达及MoDC对荧光素标记OVA抗原(FITC-OVA)的提呈作用,用CFSE标记CD4+T细胞流式细胞仪检测T细胞增殖活化活性,用RT-PCR检测T细胞Thl/Th2细胞因子(IL-4,IL-10,IL-13,IFN-y等)mRNA表达水平。结果：与对照组相比,GM-CSF预处理组MoDC Dectin-2表达明显增加,对FITC-OVA的提呈明显增强,明显促进OVA反应性T细胞增殖活化及Th2细胞因子(IL-4,IL-10,IL13) mRNA表达,向Th2分化。结论：GM-CSF促进MoDC Dectin-2表达,并增强MoDC对过敏原-卵清蛋白(OVA)提呈及促进Th2分化。图27个,表25个,参考文献150篇。