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本试验对8株分离自江苏省紫金山土壤的野生苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)进行筛选后,得到1株对食用菌异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis Frey)有较好杀虫活性的Bt菌株23-5。同时,对该菌株进行了形态鉴定、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定和杀虫蛋白基因型鉴定等研究,并对该菌株含有的杀虫蛋白基因进行了原核表达,以期为食用菌Bt微生物农药的开发和应用提供理论依据。具体研究成果如下:1.通过胃毒法测定了8个Bt菌株对异迟眼蕈蚊的室内杀虫活性,结果表明8个Bt菌株中对异迟眼蕈蚊的校正死亡率最高可达84.48%(23-5菌株),最低为43.11%。采用抑菌圈法测定了Bt菌株对平菇、毛木耳、茶树菇和双孢菇四种食用菌菌丝生长的影响,发现8个Bt菌株均减缓了四种食用菌菌丝生长速度,但最终菌丝仍然可以盖过Bt菌落继续生长。故选择校正死亡率最高的菌株23-5进行以下试验。2.对菌株23-5进行分类鉴定时主要采用形态鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定三种鉴定方法,同时采用PCR-RFLP法确定菌株23-5含有的杀虫蛋白类型。结果表明该菌株能够产生圆形或不规则形晶体,生理生化鉴定及16S rDNA鉴定结果均显示该菌株与苏云金芽孢杆菌最为接近。PCR-RFLP结果显示该菌株含有的杀虫蛋白基因型组合为cry4/10+cry11+cyt1+cyt2。所以确认该菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bt)3.以NCBI上公布的与cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2五种杀虫蛋白基因相关信息为依据,扩增菌株23-5中各杀虫蛋白基因片段,结果显示23-5中含有的cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2基因序列的长度分别为1470bp、2043bp、1941bp、750bp、792pb。各基因的克隆载体和表达载体分别构建成功后,进行PCR验证和双酶切验证。各杀虫毒蛋白基因的生物信息学分析表明Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa和Cyt2Ba蛋白均为亲水性蛋白,Cyt1Aa蛋白为疏水性蛋白,分别得到其氨基酸组成、理化性质和保守结构域。4.将各杀虫蛋白基因构建成功的表达载体进行蛋白表达和纯化,IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE结果表明杀虫蛋白Cry4B、Cry10、Cry11主要存在于表达菌株的沉淀中,呈包涵体形式,恢复其生物活性需通过变复性的方式,再进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt2主要存在于上清液,呈可溶形式表达,可直接进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt1表达不明显。融合蛋白Cry4B、Cry10、Cry11和Cyt2表达的大小分别为70KD、84KD、88kD和70kD。5.分别提取各工程菌株的目标蛋白,用Brandford法测定蛋白浓度,进行各目标蛋白的室内毒力测定。各蛋白浓度为250 ng/mL时,蛋白Cyt2对异迟眼蕈蚊的杀虫活性最高,校正死亡率达70.18%;蛋白Cry4B、Cry10、Cry11对异迟眼蕈蚊的杀虫活性较低,三者之间无显著性差异,校正死亡率为33.33-35.09%。