研究背景和目的： 炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等，刺激宿主免疫系统，释放细胞炎症介质，发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放，产生过度炎症反应，不仅不能去除机体的致病因素，反而会抑制免疫系统。其继续发展则可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能不全。SIRS共同的病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活，产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。 一氧化碳(carbon monoxide，CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生，CO过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质。最近的研究发现CO是一种气体信号分子的，在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用，并且CO在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用，但其机制尚未明确。 在本研究中，我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属一羰基化合物，一氧化碳释放分子(tricarbonyl dichlororuthenium(II)dimer，CORM-2)，通过在体和体外实验研究是否外源性CO对炎症反应具有抑制作用及其有效浓度范围，并且探讨CO的作用机制。 方法： 体外实验： 1.内皮细胞的分离培养及鉴定：足月健康新生儿脐带6小时内以胶原酶酶消化，分离人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)，接种于M199培养液内，并根据细胞的生长状态、形态特征及检测膜上特异性抗原(VIII因子)进行内皮细胞鉴定。 2.不同浓度LPS刺激对HUVEC活性的影响：用终浓度10,50,100ug/ml的内毒素(1ipopolysaccharide，LPS)刺激培养细胞4小时，观察细胞形态学变化并进行活性检测(MTT法)，确定实验浓度，建立LPS刺激的HUVEC脓毒症模型。 3.粘附分子ICAM-1，E-selectin蛋白的表达的检测：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的细胞，胞浆蛋白提取，Western-blotting法测定ICAM-1，E-selectin的蛋白表达。同时测定HUVEC iNOS，HO-1的蛋白表达。 4.观测核因子NF-KB的活性：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的细胞，进行核蛋白提取，凝胶电泳分析法(EMSA)检测NF-KB的活性。 5.多形核白细胞(PMN)粘附实验：标准右旋糖昔沉淀法和梯度离层(分离)法从健康成人静脉血中分离出PMN。Na51CrO4放射标记，与HUVEC共孵育lh，液体闪烁仪进行核素计数，计算PMN粘附率。 6.细胞一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)测定：采集有和无CORM-2干预后LPS刺激的HUVEC，用DAF-FM和双氢罗丹明123(DHRl23)作为荧光探针，流式细胞仪检测细胞内NO和ROS的水平。 7.数据以mean±sd表示，采用SAS6.02统计软件进行t检验。 在体实验： 1.严重烧伤动物模型建立：烧伤组小鼠造成1 5％TBSA全层皮肤烧伤，CORM-2(8mg/kg；i-v.)在烧伤后立即进行干预。 2.肝功能和细胞因子测定：小鼠处死后立即左心室穿刺采血，全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性。血清、肺泡灌洗液ELISA法测定TNF-a和IL-1B水平。 3.肝肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测：取肝肺组织匀浆，胞浆蛋白提取，加入反应液，分光光度计(460nm)记录30秒至90秒吸光度值之差。 4.粘附分子ICAM-l，VCAM-1蛋白的表达的检测：采集有和无CORM-2(8mg/kg；i.v.)干预烧伤小鼠肝肺组织，进行胞浆蛋白提取，Western-blotting法测定ICAM-1，VCAM-1的蛋白水平。 5.观测核因子NF-Kb的活性：采集有和无CORM-2干预后烧伤小鼠肝肺组织，进行核蛋白提取，凝胶电泳分析法(EMSA)检测NF-Kb的活性。 6.在体显微镜观察肝窦和窦后血管内白细胞黏附：利用在体显微镜观察10个视野，每个视野至少包含一条窦后静脉，和8-10个肝窦，记录滚动和黏附的细胞数。 结果： 体外实验： 与对照组比较，LPS刺激HUVEC后，细胞形态随LPS浓度增加改变明显，活性降低，10ug/ml浓度比较适合用于研究。10ug/ml LPS刺激后细胞内ROS、NO产生增加，NF-Kb活性增高，黏附分子ICAM-1蛋白表达、PMN与HUVEC的粘附比例均显著增加，E-selectind蛋白表达无显著改变。利用CORM-2干预后，细胞内ROS、NO含量及NF-Kb活性降低，粘附分子ICAM-1表达下降，PMN与HUVEC的黏附比例也随之降低。Inos的表达被CORM-2抑制，HO-1表达无明显变化。 在体实验： 小鼠在15％H3SAIIIo烧伤后24小时，血清ALT、AST的水平，肝肺组织MPO活性、ICAM-1、 VCAM-1的蛋白表达水平明显增高，在体显微镜观察，肝脏内白细胞与肝窦血管壁的黏附比例升高。CORM-2(8 mg/kg，intravenous)干预后上述情况明显改善，NF-Kb活性也明显下降。在体显微镜观察，肝脏内肝窦血管内皮细胞白细胞的聚集和黏附明显减少。 结论 本实验证实，CORM-2释放的CO具有明显的抑制炎症反应和细胞保护作用。外源性的CO可以通过抑制NFkB-的激活，减少粘附分子ICAM-1，VCAM-1的蛋白表达，从而减少肝、肺组织内白细胞滞留以及相关细胞因子和活性氧的产生，改善组织、器官功能，从而有效抑制炎症反应。