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目的探讨中药和厚朴酚抑制膀胱癌肿瘤干细胞干性维持的分子机制。方法本研究共分为两部分：第一部分,通过体外MTT实验验证和厚朴酚对膀胱癌肿瘤干细胞生存及生长的影响,ALDEFLOUR实验及荧光定量PCR法检测和厚朴酚对膀胱癌肿瘤干细胞的干性抑制作用及相关干性基因表达的影响；通过T24荷瘤裸鼠,体内验证和厚朴酚对膀胱癌肿瘤的抑制作用,同时,检测其对裸鼠肝、脾、肾的毒性作用。第二部分为机制研究,首先,通过microRNA array分析,筛选到和厚朴酚作用的下游效应分子,即miR-145,并在小鼠肿瘤组织及T24和5637膀胱癌细胞系中进行验证；利用合成的miRNA145模拟物处理T24细胞,通过ALDEFLOUR分析证明miR-145对肿瘤干性的抑制；通过ChIP实验,探索和厚朴酚致miR-145表达改变的机制；通过生物信息学分析,寻找miR-145的下游作用靶点,并运用报告质粒pCHECK2进行验证。结果①体外实验证实,和厚朴酚能显著抑制膀胱癌肿瘤细胞生存及生长,在不同浓度和厚朴酚(4.8μg/ml,9.6μg/ml,19.2μg/ml)作用72h之后,T24细胞活细胞比例分别为：82.1%、54.2%和4.2%,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；5637细胞活细胞比例分别为：78.2%、54.3%和17.2%,与对照组相比差异也均有统计学意义(P<0.05)。和厚朴酚能显著抑制膀胱癌肿瘤细胞干性,经9.6μg/ml和厚朴酚治疗后,治疗组与对照组T24膀胱癌细胞中ALDHHigh(即肿瘤干细胞)细胞比例分别为4.1%和8.4%,5637膀胱癌细胞中ALDHHigh细胞比例分别为3.4%和8.7%。经和厚朴酚作用后,相关干性基因EZH2、POU5F1、 NANOG、ALDH的表达也显著下降。②T24荷瘤裸鼠体内实验显示,和厚朴酚可有效抑制肿瘤生长,80mg/kg和厚朴酚处理组裸鼠在治疗35天后,肿瘤体积显著变小,两组肿瘤体积分别为：1240.1±2.1立方毫米和244.5±1.21立方毫米；肿瘤重量分别为：0.8±0.2克和0.2±0.1克,且对肝、脾、肾无毒性作用。③通过microRNA array分析表明,和厚朴酚作用后,肿瘤细胞中miR-145表达水平显著上升,小鼠肿瘤组织及T24和5637膀胱癌细胞系中的定量PCR分析结果与microRNA array分析结果一致。miR-145模拟物处理T24细胞后,与未处理组相比,肿瘤细胞干性亚群比例显著下降。④进一步通过ChIP实验证实,和厚朴酚处理后,miR-145启动子区域的组蛋白H3K27三甲基化水平显著下降,同时招募到miR-145启动子区域的EZH2也显著下降。⑤为进一步阐明miR-145作用的下游靶点,通过生物信息学分析发现,肿瘤干性相关基因KLF4的3’UTR有一个物种保守的miR-145识别区域,通过将KLF4基因的3’UTR克隆到报告质粒pCHECK2,将该质粒与miR-145共转染于细胞中,结果显示,miR-145可以明显降低KLF4 3’UTR的荧光活性,说明KLF4 3’UTR确实是miR-145的下游靶基因。⑥通过强制过表达KLF4发现,肿瘤细胞中干性群体上升。进一步在miR-145过转染的情况下,同时共转染KLF4表达质粒,结果表明过表达KLF4能够逆转miR-145引发的肿瘤干细胞群体下降。结论和厚朴酚作用于膀胱癌肿瘤干细胞,致细胞核中组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化(H3K27me3)水平下降,导致其对miR-145表达的抑制作用下调,miR145表达升高；而miR-145对KLF4的翻译起抑制作用,因此,致使KLF4表达下降,KLF4调控的干性基因表达下降,最终导致肿瘤干细胞干性受抑制。本研究阐明了和厚朴酚抑制膀胱癌肿瘤细胞干性的作用通路,即“和厚朴酚→H3K27me3→miR-145→KLF4→CSC",为和厚朴酚治疗膀胱癌在临床上的应用提供了理论依据,同时,也为新型膀胱癌治疗药物的研发提供了新的靶点和新思路。