CyclinA1、PTEN和P27在食管鳞状细胞癌的表达及其分子作用机制研究

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目的:探讨细胞周期蛋白A1(CyclinA1)在食管鳞状细胞癌组织(ESCC)中的表达与临床病理特征及预后关系;探讨反义核酸CyclinA1重组质粒转染对食管癌细胞株(Eca-109)的细胞增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。  方法:(1)应用Envision二步法免疫组织化学方法检测25例食管癌旁组织和68例食管鳞状细胞癌组织中CyclinA1、PTEN及P27蛋白的表达情况。运用Spearman秩相关观察CyclinA1、PTEN及P27蛋白表达的相关性。运用Kaplan-Meier生存曲线单因素分析和Cox多因素回归模型分析其表达与临床病理特征、患者预后及生物标志物之间的关系。(2)实验分三组:空白对照组(Control)、空质粒组(pIRES2EGFP plasmid)、反义核酸CyclinA1质粒组(pIRES2-EGFP-anti-CyclinA1 plasmid,简称反义组),经脂质体介导按实验分组转染食管癌Eca-109细胞株,荧光显微镜检测转染效率;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞CyclinA1、PTEN与P27 mRNA表达量和蛋白质印迹法(Westem blotting)检测Eca-109细胞转染后三者蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测Eca-109细胞转染后的增殖活性;AnnxinⅤ-APC/7-AAD双染法流式细胞仪检测Eca-109细胞转染后凋亡率。  结果:(1)食管鳞状细胞癌组织中CyclinA1、PTEN与P27蛋白阳性表达率(分别为60.3%、35.3%和41.2%)与其癌旁组织(分别为20.0%,92.0%,100%)比较有统计学意义(P<0.05),三者蛋白阳性表达均与肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级有关(P<0.05),其中CyclinA1表达与年龄有关联(P<0.05)。三者的表达与性别、浸润程度(T分期)无关。Kaplan-Meier生存分析3年生存期结果显示,食管鳞状细胞癌组织中CyclinA1表达阳性者生存率(48.8%)较阴性者生存率(74.1%)低,而PTEN和p27表达阳性者(分别为73.9%,71.4%)较阴性者(分别为51.1%、50.0%)生存率高。Cox模型多因素分析表明:食管癌组织中P27表达水平和肿瘤TNM分期是影响ESCC患者预后的独立因素(P=0.047,0.000)。(2)荧光显微镜检测显示反义核酸细胞周期蛋白A1重组质粒可成功转染Eca-109细胞;空白对照组、空质粒组、反义组的CyclinA1 mRNA表达量分别为1±0.037、1.142±0.06、0.276±0.015,反义组mRNA较其他组mRNA明显减少(P<0.05)。相应的P27 mRNA表达量分别为1±0.011、1.016±0.04、2.699±0.152;PTEN mRNA表达量分别为1±0.03、1.018±0.06、3.143±0.135; PTEN mRNA和P27 mRNA的反义组较其他组mRNA表达量明显增多,有统计学意义(P<0.05);Western blotting检测示反义组较其他组CyclinA1蛋白表达减少;而反义组的PTEN和P27蛋白表达均增高。与空白对照组和空质粒组相比,经MTT比色法和流式细胞术检测显示反义组细胞增殖率下降而细胞凋亡率显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。  结论:(1)CyclinA1、PTEN和P27的表达在食管鳞状细胞癌与癌旁组织不同,且预后相关,联合检测有可能成为评估食管鳞状细胞癌生物学行为及预后的有效指标。(2)反义核酸CyclinA1质粒转染食管癌细胞Eca-109后可有效抑制CyclinA1蛋白和mRNA表达,使PTEN和P27的蛋白及mRNA的表达上调;在细胞水平上,转染反义核酸CyclinA1重组质粒,可以使Eca-109细胞凋亡增加而细胞增殖率降低,提示CyclinA1参与肿瘤细胞周期的可能机制中包含抑制抑癌基因PTEN和P27的表达。
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