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一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli, EHEC) O157:H7是一种主要经消化道传播的病原菌,可引起出血性肠炎(haemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP)等并发症,重者可致死亡,其感染的病死率为0%-10%。自从Riley1983年首次报道由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发以来,该菌引起的暴发流行不断发生并呈上升趋势,已成为全球性公共卫生问题。因此,预防和控制EHEC O157:H7感染十分重要。目前,针对EHEC O157:H7感染尚缺乏有效的防治方法,一般采取对症治疗。尽管EHEC O157:H7对大多数抗生素比较敏感,但其被抗生素杀死后,可释放志贺毒素,加剧患者并发HUS的危险性。因此,对使用抗生素治疗应采取慎重态度。鉴于EHEC O157:H7暴发流行的严重性和抗生素治疗上的困难,疫苗的研究极为重要。EHEC O157:H7的致病性主要体现在细菌的黏附定植力和毒素两个方面,而转位紧密黏附素受体(Translocation intimin receptor, Tir)是0157：H7的一种重要毒力蛋白,经EHEC Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,TTSS)分泌并转位进入宿主细胞,定位于细胞膜上,与紧密黏附素结合后,可引起宿主细胞多聚肌动蛋白聚合,造成黏附局部微绒毛刷状缘破坏,形成特征性的黏附和擦拭损伤(attaching and effacing lesion, A/E lesion),即Tir在EHEC O157:H7的定植感染过程中起着重要的作用。因此,阻断EHEC O157:H7感染的黏附初始阶段,可避免黏附和擦拭性损伤的发生,从而终止感染。本研究从NCBI网站GenBank上查到EHEC O157:H7标准株EDL933转位紧密黏附素受体完整的编码区(cds)基因序列(Accession number NC002655.2)和氨基酸序列(protein id NP290261.1),利用生物信息学在线工具和抗原表位分析软件,预测分析其蛋白结构和抗原特性,从Tir基因全长中选取抗原表位分值高的基因进行研究(命名为Tir-C);设计特异性引物,扩增目的基因Tir-C;将目的基因连至PET-30a(+)载体上,构建重组原核表达质粒PET-30a(+)-Tir-C,转化至大肠埃希菌BL21/DE3,诱导表达和纯化重组蛋白Tir-C;将目的基因克隆入乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e中,获得重组质粒PMG36e-Tir-C,经电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌中,构建表达EHEC0157:H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗；进一步用原核表达的Tir-C蛋白、表达EHEC O157:H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌、重组嗜酸乳杆菌结合原核表达的Tir-C蛋白分别免疫小鼠,观察亚单位疫苗和重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性,探讨与比较预防EHEC O157:H7感染最有效的疫苗,为发展新型疫苗提供实验依据。二、研究方法1.EHEC O157:H7Tir基因的生物信息学分析从NCBI网站GenBank上获得EHECO157:H7标准株EDL933Tir完整的编码区基因序列和氨基酸序列；运用InterProScan分析Tir氨基酸序列；同时使用两种B细胞表位在线分析软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/与http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred/)预测Tir蛋白的B细胞表位。2.目的基因Tir-C的原核表达2.1目的基因Tir-C克隆载体的构建根据Tir基因生物信息学分析的结果,选取Tir基因全长中的一段基因作为目的片段(Tir-C)进行研究,根据该片段的基因序列设计两条引物,通过PCR,从EHEC O157:H7广州株882364染色体DNA中扩增出Tir-C基因,克隆入T载体pMD19-T中,构建和鉴定重组克隆载体pMD19-T-Tir-C。2.2目的基因Tir-C表达载体的构建利用限制性内切酶Nde I和Mo I,双酶切重组克隆载体pMD19-T-Tir-C,回收纯化目的基因Tir-C,与经过Nde I和Xho I双酶切的空质粒PET-30a(+)用T4DNA连接酶进行连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定重组表达载体PET-30a(+)-Tir-C。2.3目的基因Tir-C的表达、纯化和鉴定将重组质粒PET-30a(+)-Tir-C转化至BL21/DE3中,在异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达重组蛋白Tir-C,用12%SDS-PAGE鉴定,进一步利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。以抗6×His单克隆抗体稀释液为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG稀释液为二抗,通过Western blot方法,初步鉴定重组蛋白的免疫反应性。3.表达目的基因Tir-C的重组嗜酸乳杆菌菌株的构建3.1目的基因Tir-C的扩增根据Tir-C基因的碱基组成及乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e的酶切位点,设计特异性引物,PCR扩增目的基因Tir-C。3.2构建重组质粒PMG36e-Tir-C将目的基因克隆入乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e中,获得重组质粒PMG36e-Tir-C。3.3重组嗜酸乳杆菌菌株的构建将重组质粒PMG36e-Tir-C,经电穿孔法转化至嗜酸乳杆菌中,构建表达EHEC0157:H7Tir-C的重组嗜酸乳杆菌,经革兰染色、菌落PCR、质粒PCR、双酶切、SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。三、结果1.EHEC O157:H7Tir基因的生物信息学分析Tir基因全长1,677bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,共编码558个氨基酸；InterProScan分析该氨基酸序列含有三个结构和功能域,即Tir的N端、C端和与Intimin结合的M区；Bepipred分析预测有20个B细胞线性表位肽段,ABCPred分析预测有26个B细胞线性表位肽段,综合分析结果,拟取C端,即Tir基因全长中的1000bp-1674bp作为目的片段进行研究。2.Tir-C基因的原核表达从EHEC O157:H7广州株882364染色体DNA中扩增出Tir-C基因,大小为675bp,与预期一致,重组质粒pMD19-T-Tir-C及重组表达质粒PET-30a(+)-Tir-C经质粒VCR、Nde I和Xho I双酶切和测序鉴定,证实构建成功；目的蛋白诱导表达成功,经SDS-PAGE电泳显示与理论预测的融合蛋白分子质量相符,经纯化后获得目的蛋白Tir-C。Western blot鉴定结果显示,纯化的融合蛋白在24KDa左右处出现一条特异性条带,与预期一致。3.表达目的基因Tir-C的重组嗜酸乳杆菌菌株的构建成功扩增出目的基因Tir-C,克隆入表达质粒PMG36e中,获得重组质粒PMG36e-Tir-C,经电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌ATCC4356中,经镜下观察细菌形态学的变化、菌落PCR、质粒PCR、双酶切、SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,证实表达EHEC O157:H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌菌株构建成功。四、结论1.选取的Tir-C基因抗原表位预测分值较高,大小为675bp。2.成功构建重组克隆载体pMD19-T-Tir-C和PET-30a(+)-Tir-C原核表达载体。细菌培养物经IPTG诱导表达出重组融合蛋白,纯化得到重组融合蛋白,分子量大小为24KD左右。Western blot初步鉴定该融合蛋白有一定的免疫反应性。3.表达EHEC O157:H7Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌菌株证实构建成功。