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随着人类社会步入工业化时代,化石燃料也逐步走到枯竭的边缘,为了甩开这个阻碍社会进步的“绊脚石”,人们需要加快能源结构转型,寻找新的可再生能源,而木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源之一,其含量最多的一种组分是纤维素,纤维素作为植物细胞壁的主要成分,为植物病原菌的侵入提供物理屏障。面对这种顽固的晶体结构,单独地利用纤维素酶难以达到高效降解的目的,后来人们试图寻找新的辅助酶类,多糖单加氧酶（PMOs）的发现吸引了众多研究者的目光,这类酶是通过氧化裂解的方式切割糖苷键,达到破坏多糖晶体结构的目的。因此,PMOs的研究不仅为生物质降解提供重要的手段,还为研究病原菌的致病机理提供重要依据。本研究以嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）多糖单加氧酶CtPMO9A为研究对象,利用薄层层析色谱法（TLC）、高效液相色谱-示差折光检测法（HPLCRID）、飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、三氟乙酸水解、甲基化、硼氢化钠还原和定点突变等方法,对其酶活性进行深入的研究;另外,采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法检测CtPMO9A与纤维素酶（EGⅡ、BGLI和CBHI）的协同效应。本文设置了一系列的反应温度（40、50、60、70℃）和反应p H（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）研究CtPMO9A降解磷酸膨胀纤维素（PASC）的能力,通过TLC分析酶解产物中的非氧化型寡糖,再利用三氟乙酸水解酶解产物,结合HPLC-RID检测C1氧化产物（葡萄糖酸）,结果确定CtPMO9A的最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0。在最适反应条件下,对酶解产物进行硼氢化钠还原处理,通过HPLC-RID检测到存在C4氧化产物（半乳糖）,再利用MALDI-TOF-MS分析甲基化处理后的酶解产物,检测到C1（m/z+30）和C4（m/z-16）的氧化型寡糖,结果表明CtPMO9A对底物具有C1和C4氧化的功能。根据定点突变的原理,将CtPMO9A活性中心的氨基酸（His1、His83、Tyr168）突变为丙氨酸（Ala）,并与底物PASC进行反应,通过TLC分析可溶性酶解产物,均未检测到非氧化型寡糖,HPLC-RID也未检测到C1、C4氧化产物,表明将CtPMO9A活性中心位点（His1、His83、Tyr168）突变后,使酶活性完全丧失。同时,将活性中心附近的第166位谷氨酰胺（Gln166）突变为Q166A和Q166E,TLC结果显示Q166A的酶解产物中无非氧化型寡糖,Q166E的酶解产物中具有单糖至二糖;对于突变酶Q166A来说,HPLC-RID和MALDI-TOF-MS均未检测到氧化型寡糖,而在突变酶Q166E的产物中检测到C1氧化产物,分析结果说明Q166A丧失了C1和C4氧化活性,Q166E保留了部分C1氧化活性。综上所述,表明活性中心氨基酸对CtPMO9A的酶活性起着关键性的作用,而活性中心附近的Gln166位点不仅参与断键反应而且具有可替代性。通过对CtPMO9A与纤维素酶（EGⅡ、BGLI和CBHI）协同作用的探究,发现利用CtPMO9A预处理磷酸膨胀纤维素（PASC）,使还原糖产量分别提高2.10倍、2.08倍和2.16倍,协同度分别是1.022、0.799和0.875。当利用CtPMO9A分别与EGⅡ、BGLI和CBHI处理CMC-Na时,使还原糖产量分别提高0.94倍、3.38倍和1.55倍,协同度为0.751、0.932和0.804;而处理玉米芯时,CtPMO9A与BGLI的协同催化效果不佳,其与EGⅡ和CBHI处理得到的还原糖产量分别提高0.64倍、0.21倍,协同度为1.009、0.612。同时,为优化混合酶的反应比例,利用DNS法和HPLC-RID分别检测CtPMO9A与EGⅡ共同降解PASC的效果,结果发现当EGⅡ占混合酶体系0.4%时,还原糖产量比纤维素酶单独处理底物时增加5.41倍,葡萄糖酸的含量最多。总体而言,利用CtPMO9A预处理人工合成的纤维素（PASC、CMC-Na）和天然的纤维素（碱处理的玉米芯）后,纤维素酶的降解效率发生不同程度的提高,而混合酶的比例也会影响降解PASC的效果。