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糖基化被认为在肿瘤的恶性转化过程中起着关键作用,与癌症进程相关途径有着密切的关系。唾液酸化的改变在癌症中普遍存在,唾液酸化的产物在肿瘤进展的不同阶段介导病理生理反应。细胞内的唾液酸化是由细胞内的唾液酰基转移酶催化的生化过程。唾液酰基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的酶。在恶性肿瘤中,ST6GALNAC1将唾液酸添加到丝氨酸或苏氨酸残基上的α-2,6键上,在各种类型的肿瘤中发挥重要作用。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号通路,在人体的发育和成体稳态的维系中起着至关重要的作用,它的异常激活与多种人类癌症密切相关。当Wnt蛋白与细胞表面Frizzled受体家族结合时会引起一系列的细胞内的反应,包括Dishevelled受体家族蛋白质的激活及最终细胞核内β-catenin水平的变化。Dishevelled是细胞膜相关Wnt受体复合物的关键成分,它与Wnt结合后激活,抑制下游蛋白β-catenin的降解。当β-catenin降解复合物被抑制后,细胞内的β-catenin得以稳定存在,部分β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达,如与细胞周期和凋亡相关的基因c-myc和Cyclin D1、生长因子VEGF、胃泌素、HGF、c-met,以及参与肿瘤进展的基因MMP7、CD44、ITF-2、COX2等。因此,Wnt信号的异常激活是癌症的重要原因之一。糖基化水平的改变将影响很多生理反应,包括Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路中Wnt蛋白本身是N-糖蛋白,如Wnt3a中N-聚糖修饰是其功能所必需的。但是Wnt3a能否被O-聚糖修饰还未知。据研究在大肠癌中异常O-糖基化细胞的外泌体中CD44的比例明显高于正常细胞,因此我们得知糖基化会影响外泌体的分泌。Wnt3a是分泌性蛋白,为了行使其功能将依赖外泌体分泌到细胞外起作用,我们猜测Wnt3a的糖基化修饰有可能将影响其外泌体分泌。另外,很多研究表明耐药性与糖基化有关。例如在多药耐药的肿瘤细胞中,神经酰胺糖基化的能力变强,阻断了神经酰胺的糖基化,进而提高细胞内神经酰胺的表达水平,诱导多药耐药细胞(Multidrug Resistance,MDR)发生凋亡。但ST6GALNAC1引起的唾液酸化在耐药中的作用尚不明确。基于以上的研究背景,我们发现ST6GALNAC1介导的唾液酸化在肿瘤的进程中发挥重要的作用,但其作用机制尚不明确。另外,Wnt3a作为经典的Wnt信号通路的重要配体,其糖基化修饰与其功能其分泌有着相关性。但是,Wnt3a能否被唾液酸化,唾液酸化后能否影响其分泌至今无相关报道。我们通过在线工具分析的结果提示Wnt3a有着能被唾液酸化的位点。因此,我们假设肿瘤细胞中异常表达的ST6GALNAC1可能通过唾液酸化Wnt3a影响其异常分泌,进而影响经典的Wnt/β-catenin信号通路,最终影响肿瘤的进程及其药物敏感性。为了验证假设,我们将从如下的实验目的出发进行研究。研究目的:探究ST6GALNAC1对Wnt3a的唾液酸化修饰及其功能的影响;探究ST6GALNAC1对癌症增殖侵袭迁移能力的影响;探究ST6GALNAC1在顺铂耐药卵巢癌细胞中的作用。实验方法:(1)用慢病毒载体系统构建稳定敲低ST6GALNAC1基因的A375、SK-MEL-28和A2780s细胞株。(2)在线预测并做凝集素沉淀反应检测Wnt3a蛋白的唾液酸化。(3)Western Blot和实时荧光定量PCR验证ST6GALNAC1基因的表达水平。(4)Western Blot检测ST6GALNAC1是否影响Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。(5)CCK-8实验、划痕实验、Transwell检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。(6)Western Blot检测外泌体中Wnt3a蛋白及其外泌体标志蛋白的表达量。(7)Western Blot和实时荧光定量PCR检测耐药细胞ST6GALNAC1基因的表达。(8)用慢病毒载体系统构建稳定敲低ST6GALNAC1基因的A2780cp细胞株。(9)CCK-8实验检测A2780cp耐药细胞耐药性的改变。(10)划痕实验、Transwell实验检测A2780cp耐药细胞迁移、侵袭能力的改变。实验结果:(1)Western Blot和实时荧光定量PCR结果显示,用慢病毒载体系统构建稳定敲低的ST6GALNAC1基因后,ST6GALNAC1表达降低。(2)在线预测和凝集素沉淀反应检测出Wnt3a蛋白能被ST6GALNAC1唾液酸化。(3)CCK-8实验结果表明,敲低ST6GALNAC1基因后,细胞增殖能力下降;划痕实验结果表明细胞迁移能力下降;Transwell实验结果表明细胞侵袭能力下降。(4)Western Blot实验结果表明ST6GALNAC1基因敲低后,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达降低。(5)Western Blot检测出外泌体中运输的Wnt3a蛋白的量变少,细胞分泌外泌体的量变少。(6)Western Blot和实时荧光定量PCR检测ST6GALNAC1基因在A2780cp耐药细胞中高表达。(7)CCK-8实验表明ST6GALNAC1增加A2780cp耐药细胞对顺铂的耐药性。(8)划痕实验、Transwell实验表明ST6GALNAC1抑制A2780cp耐药细胞的迁移和侵袭。实验结论:ST6GALNAC1能够唾液酸化Wnt3a蛋白;抑制ST6GALNAC1的表达导致Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达量降低,进而导致癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著性地降低;抑制ST6GALNAC1的表达使得癌细胞唾液酸化水平下降,导致外泌体分泌量减少。ST6GALNAC1在A2780cp耐药细胞中高表达,能够加强细胞对顺铂的耐药性,并能增加细胞的侵袭迁移能力。