目的：　　为了提高重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET24a-SA-hGM-CSF的产量和表达量。通过单因素优化实验，在摇瓶中对培养基成分和培养条件进行了一系列优化，得到最佳发酵条件。随后，在摇瓶表达条件基础上，通过正交试验进行了10L发酵罐(BioFlo(R)415)的表达工艺摸索，最后确定出适合SA-hGM-CSF高密度发酵的工艺路线。最后，DEAE FF纯化及柱上复性。研究SA-hGM-CAF中试制备工艺，为后续的扩大培养奠定了基础。　　方法：　　1. SA-hGM-CSF融合蛋白的发酵工艺　　1)摇瓶发酵的研究　　通过单因素优化实验，在摇瓶中对培养基的成分以及诱导表达条件进行优化，包括:碳源、有机氮源、无机盐、诱导剂浓度、诱导时间、pH和温度。　　2)10L发酵罐发酵的研究　　在摇瓶发酵的基础上，采用四因素三水平的正交试验(L9(43))对10L发酵罐的发酵过程中的pH、补料开始时间、诱导温度、诱导时机进行优化。　　2. SA-hGM-CSF融合蛋白的纯化与复性　　收集工程菌，菌体经高压破碎仪破菌，将获得的包涵体经包涵体洗涤液洗涤后再用包涵体溶解液溶解，随后，对融合蛋白进行DEAE FF离子交换层析纯化条件的摸索，采用DEAE FF柱上复性法将纯化后的目的蛋白进行复性。RP-HPLC检测SA-hGM-CSF融合蛋白的纯度。　　3. SA-hGM-CSF融合蛋白的生物学功能的检测　　CCK-8法检测SA-hGM-CSF融合蛋白和hGM-CSF标准品对TF-1细胞增殖的活性，比较两者活性的大小;应用FCM检测SA-hGM-CSF融合蛋白对生物素化的MB49细胞的锚定率。　　结果：　　1. SA-hGM-CSF融合蛋白的发酵工艺　　1)摇瓶发酵　　通过摇瓶单因素的优化实验，初步摸索出最佳的培养基（即发酵培养基）:蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO4·3H2O1.5g/L，KH2PO42.3g/L，(NH4)2SO42.4g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L;摇瓶的表达参数是: IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导时间为5h， pH=7.0，温度37℃，整个摇瓶发酵持续时间为9小时。　　2)10L发酵罐发酵　　正交试验结果分析，最后确定出适合SA-hGM-CSF融合蛋白高密度发酵的工艺路线。即:将优化后的发酵培养基在10L发酵罐(BioFlo(R)415)中原位灭菌后，按5％接种量将二次活化的种子液接种到发酵罐中。发酵的设置参数为:转速250-650 rpm，温度37℃，氧容量控制在50±5％，通气量、通氧气、搅拌速度与DO连动，pH=7.0。当发酵至3h时，采用连续补料的方式给与添加补料，待菌密度OD600=3.0时，一次性加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.5mM，并设定诱导温度为32.5℃。检测发酵过程中的搅拌转速及通氧量使发酵液维持在适当的溶氧量范围内，以pH调节物稳定发酵液pH，发酵持续时间约10小时，每升培养液可收获湿菌体达30g左右，表达水平达50％以上。　　2. SA-hGM-CSF融合蛋白的纯化与复性　　经包涵体洗涤液洗涤后，目的蛋白的纯度已达到60％左右，经过DEAE FF离子交换层析纯化和柱上复性后，SDS-PAGE和RP-HPLC分析，融合蛋白的纯度达到95％、回收率达70％以上。复性后，SA-hGM-CSF融合蛋白主要以单体和多聚体形式同时存在。　　3. SA-hGM-CSF融合蛋白的生物学功能检测　　SA-hGM-CSF双功能融合蛋白具有显著的增殖TF-1细胞的活性，且呈剂量依赖性，和hGM-CSF标准品相比，两者无明显的差别。其EC50分别为1.460和1.455，活性分别是0.685×106和0.687×106; FCM检测了SA-hGM-CSF双功能融合蛋白对已生物素化的MB49膀胱癌癌细胞的锚定率，其锚定率可高达99％左右。　　结论：　　本实验对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET24a-SA-hGM-CSF的发酵工艺进行了系统性的研究，确定了最佳的发酵培养基及发酵参数，实现了SA-hGM-CSF的高效表达。通过DEAE FF离子交换层析纯化、柱上复性SA-hGM-CSF融合蛋白，体外TF-1细胞增殖实验和细胞锚定实验初步证实了SA-hGM-CSF融合蛋白同时具有双功能活性:促进TF-1细胞增殖和锚定修饰生物素化的MB49细胞膜的活性，为后续的SA-hGM-CSF的工艺化生产及临床研究奠定了基础。