目的:子宫内膜癌占女性癌症的7%,占女性生殖系统肿瘤的20%-30%。近年来,在世界范围内子宫内膜癌的发病有上升趋势,并呈年轻化。手术治疗是子宫内膜癌患者的首要选择,但单纯手术治疗对患者的生存率和生活质量的提高仍不尽如人意。研究表明,手术治疗联合化疗对具有高危因素的子宫内膜癌复发早期具有一定的预防作用,对晚期和复发的子宫内膜癌患者也有一定的客观有效率,而应用化疗药物必然会出现化疗药物的耐药问题。化疗耐药问题是当今肿瘤研究的热点。顺铂(CDDP)是化疗药物当中的核心药物,对肿瘤细胞的杀伤作用比较强,但随着应用顺铂浓度的升高,肿瘤细胞产生耐药性,且化疗患者也出现了不可避免和忽视的较重的不良反应。人们意识到选择一种能与顺铂联合应用,不仅能提高对肿瘤细胞的杀伤力,降低耐药性,还能降低顺铂的用药浓度,减少患者的不良反应的药物成为必然。有研究证实:足叶乙甙(vp-16)能与肿瘤细胞中的凋亡抑制蛋白Livin的表达相互拮抗,与CDDP联合应用能有效降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,从而有效杀死肿瘤细胞,但其机制仍未完全阐明。本研究应用足叶乙甙联合顺铂体外干预子宫内膜癌细胞(ISHIKAWA),比较不同用药方案下ISHIKAWA细胞的生长以及凋亡情况,进一步探讨足叶乙甙联合顺铂化疗方案的机制。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族的新成员,是目前IAPs家族中抗凋亡活性最强的因子,是当前研究化疗耐药相关凋亡蛋白的热点。Livin能抑制caspase的活性,在肿瘤细胞耐受药物、诱导凋亡中起着关键性作用。Livin的高表达能增加癌细胞对化疗药物的耐受性,因此减少Livin的表达为抗肿瘤治疗提供新思路。体内外研究表明,应用smac反义核苷酸、RNA干扰等多种方法下调Livin的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡及提高对化疗药物的敏感性而抑制肿瘤细胞生长。Livin在许多恶性肿瘤组织中高表达,通过复杂的信号通路发挥广泛的抗凋亡效应,参与肿瘤的发生、发展、复发、耐药等生物学过程。Livin的过表达,导致了肿瘤细胞对化学药物等促凋亡刺激的耐受,而耐药是我们临床上亟待解决的问题。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行酶之一,在细胞凋亡的执行阶段,caspase-3全部或部分负责大量底物的蛋白水解。各种凋亡信号可刺激细胞内多种信号传导途径,但最终将汇集为caspase蛋白酶级联放大反应这一共同通路。凋亡的最后实施主要是通过caspase-3的激活实现的,是凋亡的共同通路。本研究通过流式细胞分析术、western blotting半定量分析各种药物作用后肿瘤细胞的凋亡情况,以及不同用药方案后Livin与caspase-3的表达情况以及两者之间的相关关系,从细胞凋亡角度探讨化疗耐药问题的机制。方法:1细胞培养:子宫内膜癌高分化腺癌细胞株(ISHKAWA)购自河北医科大学第四医院肿瘤研究所。常规方法复苏冻存于液氮罐中的ISHKAWA细胞,接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养,密切观察细胞生长情况,待细胞生长至70%融合时以EDTA传代细胞。2药物浓度选择、试验分组:参考药物的血浆峰浓度(PSC)进行试验分组。VP-16的PSC为5μg/ml,CDDP的PSC为3μg/ml ,实验组:(1)正常对照组。(2)VP-16组:分别用VP-16的终浓度(μg/ml):0.05、0.5、5、50、500μg/ml作用于细胞。(3)VP-16+CDDP组:用CDDP的PSC浓度分别与VP-16的上述五种浓度合用。(4)CDDP组:用CDDP的PSC浓度作用于细胞。3应用MTT法检测各实验组ISHIKAWA细胞株的生长抑制情况,计算细胞增值抑制率,利用金氏公式判断两药的合用效应。4流式细胞仪检测各实验组的ISHIKAWA细胞的凋亡率变化情况,了解不同用药方案对肿瘤细胞生长的影响。5 Western blotting免疫印迹方法测定各个实验组Livin、caspase-3的表达情况,根据目的蛋白的变化趋势及相关关系探讨化疗耐药问题的机制。6统计学方法:所有资料均用计算机统计软件spss(13.0)进行统计分析。实验数据以均数±标准差( X±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,western blotting结果应用quantity-one系统进行条带峰值面积和光密度定量。判断标准:以p<0.05,为有统计学意义。结果:1 MTT检测结果:根据金氏公式计算可得,不同浓度VP-16(0.05μg/ml,0.5μg/ml, 5μg/ml, 50μg/ml,500μg/ml)与CDDP的血浆峰浓度合用的Q值分别为0.91(+),1.18(++),1.31(++),0.89(+),0.85(+),不同浓度VP-16与CDDP合用均有协同作用,其中尤以VP-16血浆峰浓度5μg/ml与CDDP合用时Q值为1.31(++),协同作用最明显。2流式细胞分析结果:不同浓度VP-16(0μg/ml,0.5μg/ml,5μg/ml,50μg/ml)作用于细胞,24h后细胞的凋亡率分别为(9.6±3.1)%,(21.5±2.7)%,(30.4±1.5)%,(43.4±1.8)%,以上各浓度的VP-16与CDDP合用于细胞,24h后细胞的凋亡率分别为(15.2±1.5)%,(28.7±2.8)%,(45.7±3.5)%,(47.2±2.1)%,可见药物合用组比单用组细胞的凋亡率高,低浓度VP-16(0.5μg/ml,5μg/ml)与CDDP合用对细胞的凋亡率的影响p<0.05,有统计学意义;高浓度VP-16(50μg/ml)与CDDP合用对细胞的凋亡率的影响p>0.05,无统计学意义。3 western blotting检测结果:不同浓度VP-16(0μg/ml,0.5μg/ml,5μg/ml,50μg/ml)作用于细胞后,Livin蛋白表达量分别为0.18±0.01,0.14±0.01,0.08±0.01,0.05±0.01;相应VP-16浓度与CDDP合用后Livin蛋白表达量分别为0.11±0. 01,0.11±0. 01,0.06±0.01,0.04±0.01。可见合用组Livin蛋白表达量较单用组的减少,差异有统计学意义(p<0.05)。不同浓度VP-16(0μg/ml,0.5μg/ml,5μg/ml,50μg/ml)作用后,caspase-3蛋白表达量分别为0.69±0.08,1.00±0.05,1.15±0.04,1.22±0.04.相应VP-16浓度与CDDP合用后,caspase-3蛋白表达量分别为0.85±0.02, 1.05±0.04,1.18±0.03, 1.37±0.14.可见合用组caspase-3蛋白表达量较单用组的增加,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1 VP-16的各个浓度与CDDP的血浆峰浓度合用均有协同效应,且VP-16的血浆峰浓度与CDDP的血浆峰浓度合用的协同效应最明显。随着VP-16浓度的升高,药物对细胞的抑制率呈增高趋势。且纵观各实验组药物合用组较单用组对细胞的抑制率高。2随着VP-16浓度的升高,癌细胞胞的凋亡率有所升高,CDDP与VP-16合用后凋亡率较单用VP-16的细胞凋亡率升高,VP-16低浓度(0.5μg/ml,5μg/ml)单用药实验组与合用药实验组比较差别有统计学意义(p<0.05)。VP-16高浓度(50μg/ml)单用药实验组与合用药实验组比较差别无统计学意义(p>0.05)。3 Western blotting结果显示:Livin蛋白在空白对照组高表达,VP-16作用后Livin的表达有所减少,VP-16+ CDDP作用后Livin的表达减少明显,单用药实验组与合用药实验组比较差别有统计学意义(p<0.05)。caspase-3蛋白的表达则与Livin蛋白的表达呈明显的负相关趋势,单用药实验组与合用药实验组比较差别有统计学意义(p<0.05)。