论文部分内容阅读
β-半乳糖苷酶通常被称为乳糖酶，它广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及动物肠道中。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，主要用来治疗乳糖不耐受症，处理加工牛乳、乳清，生产低乳糖牛奶和乳制品。近几年随着人们对乳糖不耐受症认识的深入，乳糖酶在食品和乳制品工业中的作用日益显著。但目前常用的乳糖酶其最适反应温度大多较高，对pH的要求比较严格，从而其生产成本相对较高，也要消耗不少的能源；因此，寻找一种在较低温度和较大范围pH下具有高酶活的乳糖酶，对于降低成本、节约能源，具有重要的应用价值。
本文从油田废坑土样中筛选到一株产β-半乳糖苷酶的低温盐碱菌。通过对菌株L3生理生化特性的研究和16SrDNA的分子鉴定，初步鉴定该菌株属于Planococcussp.，命名为Planococcussp.L3。在温度(4℃-30℃)，pH(7.0-11.0)，NaCl浓度(0％-15％)范围内，该菌株均适宜生长。最适生长温度是25℃，最佳生长pH值是9.0，最适生长的NaCl浓度为2％。除此以外，还研究了碳氮源、金属离子等其它外界环境条件对菌株生长的影响。该菌株L3产生的β-半乳糖营酶为胞内酶，对粗酶液的酶活性及耐受性的研究发现，酶的最适反应温度、最适反应环境的pH值均与该菌的最适生长条件-致，即25℃、pH值9.0，而且该酶在高盐浓度下仍有高活性。
通过去除pUC19的LacZ序列，获得了不含LacZ基因的质粒p△LacZ。以p△LacZ为载体，构建了该菌株的基因组文库，从该文库中筛选到了含有β-半乳糖苷酶基因的4.2kbHindⅢ片段。该片段含有两个开放读码框，长度分别为1659bp的ORF1和2031bp的ORF2。BLAST分析表明：ORF1和ORF2在NCBI上比对的结果都是β-半乳糖苷酶序列，与ORF1同源性最高的为Bacilluscirculans的β-半乳糖苷酶(登录号：BAA21669)，同源性仅为46％。而与ORF2同源性最高的是一株低温Planococcussp.’SOSOrange的耐盐β-半乳糖苷酶(登录号：AAF75984)，同源性为92％。为进一步了解ORF1和ORF2所编码的β-半乳糖苷酶同其它β-半乳糖苷酶之间的关系，用CLUSTE软件对它们的序列进行比较，并用MEGA3.0软件构建了它们的氨基酸序列系统发生进化树，结果表明本论文从一株低温盐碱细菌中克隆到两个完全不同的新β-半乳糖苷酶基因。