唾液酸作为重要的生物信息传递分子,在生物体内有着十分重要的生物学功能。而合成唾液酸糖苷类化合物可以为研究其竞争唾液酸受体结合位点和进一步探讨生物机体内唾液酸代谢过程及其作用机制提供材料。目前利用化学合成法和天然提取法制备唾液酸糖苷类化合物,其产物收率效益较低,反应条件苛刻,且会对环境造成较大的污染,可见简单的天然提取和化学合成过程并不能满足唾液酸糖苷类化合物的生产需求。因此本研究探索了脱乙酰基酶在37℃无保护基团的条件下催化N-乙酰化反应的作用,以期替代化学-酶法合成途径中的化学合成过程,完善多种唾液酸糖苷类化合物的全酶法合成途径。此外唾液酸醛缩酶是酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径中的关键酶,而目前已挖掘的商品型唾液酸醛缩酶价格较为昂贵,且多需在培养基中添加N-乙酰神经氨酸作为诱导剂才可表达生成,因此本论文拟从P.heparinus基因组中挖掘编码唾液酸醛缩酶的基因PhNeuLy3300,构建其工程菌进行体外异源表达,结合本实验室发掘的四种工具酶,探索“一釜五酶”法合成多种唾液酸糖苷类化合物的途径。目前关于各类方法合成所得的唾液酸糖苷类化合物还缺乏结构鉴定的相关研究,本论文将对合成的产物继续纯化并利用核磁共振仪器进行结构分析,以填补目前存在的空白,进一步分析该全酶法合成途径的特点。具体研究内容和结果如下:1.唾液酸醛缩酶的重组表达、酶活检测及脱乙酰基酶的N-乙酰化活性研究以细菌属Pedobacter heparinus作为研究菌株,通过生物信息同源比对,找到其编码唾液酸醛缩酶的基因PhNeuLy3300。利用基因工程手段构建PhNeuLy3300的工程菌,并进行体外异源表达及纯化,经SDS聚丙烯酰胺凝狡电泳检测证明,纯化后可以得到纯度较高的重组唾液酸醛缩酶。酶标仪法检测酶活结果表明,该PhNeuLy3300酶具有较好的活性,能作为唾液酸糖苷类化合物合成途径中的关键酶使用。以CmCBDA脱乙酰基酶分别催化D-盐酸氨基葡萄糖和4种不同的有机酸(乙酸或丙酸或羟基乙酸或巯基乙酸)发生N-乙酰化反应,经1H-N-MR分析,本研究成功合成了N-乙酰葡萄糖胺、N-丙酰葡萄糖胺、N-羟乙酰葡萄糖胺及N-巯基乙酰葡萄糖胺,且产物产率依次为69%、68%、77%及77%,证明该脱乙酰基酶能成功催化D-盐酸氨基葡萄糖和各类有机酸发生N-乙酰化反应,作为探索全酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径的工具酶。2.全酶法合成4种唾液酸糖普类化合物以D-盐酸氨基葡萄糖和4种不同的有机酸(乙酸或丙酸或羟基乙酸或琉基乙酸)分别为底物,使用定量的PhNeuLy3300酶及本实验室保藏的CmCBDA酶(脱乙酰基酶)、PhGn2E3295酶(N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶)、NmCTT酶(CMP-唾液酸合成酶)、PdST6酶(唾液酸糖基转移酶)—“一釜五酶”合成多种唾液酸糖苷类化合物,经高效液相色谱-质谱联用仪检测结果表明,该全酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径成功合成了 X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神经氨酸及X-Gal-N-琉基乙酰神经氨酸4种唾液酸糖苷类化合物,其产率依次为98%、94%、29%及92%,表明该全酶法合成途径可行并且具有较高的产物转化率。此外,该全酶法合成途径反应条件温和,操作简单,且无需特殊的化学反应设备及有毒试剂,因此不会造成环境污染等问题。3.产物的纯化及核磁共振分析由C18固相萃取柱及硅胶柱对含X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神及X-Gal-N-巯基乙酰神经氨酸产物的反应样液进行去酶、盐、X基团,高效液相色谱检测结果显示无杂峰,证明得到的产物纯度较高,且无副产物生成。经核磁共振仪对纯化后的样品X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神进行1H-NMR、13C-NMR分析,结果表明产物与理论目标产物结构一致,无杂质信号峰出现,即证明该全酶法合成途径具有提取简单、产品纯度高等优点。