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肝纤维化是由于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解导致过度沉积,是纤维增生与纤维分解不平衡而引起的病理过程。芍药苷(paeoniflorin, Pae)是白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)中的主要有效成分,本课题组以往研究发现,TGP具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肝损伤和肝纤维化等作用。b-arrestins对绝大部分G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor, GPCR)介导的信号转导通路具有调节作用。越来越多的研究表明,除了调节GPCR信号通路以外,b-arrestin作为调节分子也在其他多种细胞内信号通路中发挥重要作用。本实验在以往研究基础上,采用猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型,首先从整体水平考察了免疫性肝纤维化过程中大鼠肝脏b-arrestin1、b-arrestin2表达水平的变化;体外选用HSC-T6(hepatic stellate cell,HSC)细胞株,从细胞和分子水平探讨b-arrestin1、b-arrestin2在HSC表达的变化,并以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰HSC-T6中β-arrestin2基因表达,进一步探讨其在HSC异常增殖和凋亡中的作用及相关机制,同时观察Pae对HSCb-arrestin1、b-arrestin2表达的影响。 目的:采用猪血清诱导的免疫性肝纤维化模型,观察免疫性肝纤维化大鼠肝脏中b-arrestin1、b-arrestin2和α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)的表达情况;以肝纤维化过程中的关键细胞HSC-T6为突破口,观察b-arrestins在血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB)刺激HSC-T6增殖中的作用及Pae对其的影响;进一步应用针对b-arrestin2的 siRNA转染 HSC-T6,探讨b-arrestin2在HSC异常增殖和凋亡中的作用及相关机制。 方法:Wistar大鼠腹腔注射猪血清建立免疫性肝纤维化模型,设立正常对照组(0周)、模型组(3、6、9、12、16周),免疫组织化学染色法、蛋白免疫印迹法检测肝脏中b-arrestin1、b-arrestin2与a-SMA表达水平的变化。体外建立PDGF-BB诱导的HSC-T6增殖模型,分别采用50μg·L-1 PDGF-BB刺激HSC-T615min、30min、1h、2h、4h、8h,Western-blot法检测b-arrestin1和b-arrestin2的表达变化。在PDGF-BB刺激的HSC-T6中加入不同浓度的Pae(10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1),Western-blot法检测Pae对PDGF-BB刺激HSC-T6b-arrestin1、b-arrestin2表达的影响。将化学合成的siRNAβ-arrestin2以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照,采用逆转录-聚合酶链反应和Western blotting检测细胞β-arrestin2表达;MTT法检测siRNA转染后HSC-T6增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞凋亡;采用Western blot法检测siRNAβ-arrestin2转染后HSC-T6中Bcl-2、Bax、ERK、p-ERK蛋白的表达水平的变化。 结果: 1.免疫性肝纤维化大鼠肝脏中b-arrestin1、b-arrestin2与a-SMA的表达情况 Wistar大鼠腹腔注射猪血清在16周时可以成功建立免疫性肝纤维化模型。免疫组织化学染色与 Western-blot法检测发现免疫性肝纤维化大鼠肝脏中b-arrestin2和a-SMA的表达伴随造模时间的延长逐渐增加,而b-arrestin1的表达无明显变化。a-SMA是激活的HSC的表面标志,相关性分析结果显示b-arrestin2表达的升高和a-SMA的表达呈明显正相关(r=0.860,P<0.05)。 2. PDGF-BB刺激的HSC-T6中b-arrestin1、b-arrestin2表达的变化 体外建立PDGF-BB诱导的HSC-T6增殖模型,采用PDGF-BB(50μg·L-1)分别刺激HSC-T615min、30min、1h、2h、4h、8h。Western-blot结果发现,随着刺激时间的延长,PDGF-BB可明显促进HSC-T6中b-arrestin2的表达升高,并在2h达到峰值,b-arrestin1无明显变化趋势。 3. siRNAβ-arrestin2对PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖的影响 RT-PCR结果经计算机灰度扫描并与内参照比较分析后显示,在转染 siRNAβ-arrestin2后HSC-T6β-arrestin2 mRNA较空白对照组和阴性对照组mRNA水平分别下降70±1.76％和69±1.93%。Western blot分析结果显示,HSC-T6在转染siRNAβ-arrestin2后β-arrestin2蛋白表达被抑制了68.43±2.88%,而阴性对照组及空白对照组细胞的β-arrestin2蛋白表达无显著性变化。MTT结果表明,转染 siRNAβ-arrestin2明显抑制PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖。 4. siRNAβ-arrestin2对PDGF-BB刺激的HSC-T6 ERK1/2通路的影响 Western-blot检测发现,PDGF-BB刺激HSC-T615min可引起ERK1/2磷酸化水平明显升高,将针对β-arrestin2的siRNA转染HSC-T6可被明显抑制ERK1/2的激活,降低p-ERK1/2水平。 5. siRNAβ-arrestin2对HSC-T6凋亡的影响 流式细胞术检测结果表明,转染β-arrestin2siRNA的 HSC-T6细胞凋亡率为37.5%,明显高于正常HSC对照组;进一步研究发现,转染针对β-arrestin2的siRNA沉默β-arrestin2基因表达后,HSC-T6中Bcl-2蛋白被抑制了32.58±3.46%(P<0.01),而Bax表达增加38.00±3.72%(P<0.01)。 6. Pae对PDGF-BB刺激的HSC-T6b-arrestins表达的影响 在PDGF-BB刺激的HSC-T6中加入不同浓度的Pae(10-5mol·L-1、10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1)后,Western-blot法检测不同浓度的Pae对PDGF-BB(50μg·L-1)刺激HSC-T6中b-arrestin1、b-arrestin2表达的影响。结果发现,Pae(10-5mol·L-1、10-6mol·L-1)可明显抑制PDGF-BB刺激引起的HSC-T6 b-arrestin2的表达升高;Pae对b-arrestin1的表达无明显影响。 结论: 1.猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝脏组织中β-arrestin2表达水平随造模时间的延长有增加趋势,并且β-arrestin2表达的增加与激活的HSC表面标志a-SMA表达呈明显正相关,提示β-arrestin2可能是导致免疫性肝纤维化大鼠HSC异常增殖的重要分子。体外研究表明PDGF-BB可以明显促进HSC-T6中β-arrestin2的表达,从而刺激了HSC-T6过度增殖,提示β-arrestin2可能是HSC过度增殖的关键分子。2. PDGF-BB刺激HSC-T6可引起ERK1/2的迅速磷酸化,siRNAβ-arrestin2转染HSC-T6可明显抑制ERK1/2的激活,降低p- ERK1/2水平。提示β-arrestin2可能通过激活ERK1/2通路介导HSC的增殖。 3. siRNAβ-arrestin2转染HSC-T6可明显促进其凋亡,同时减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达。提示β-arrestin2可能通过调节Bcl-2/Bax比例在HSC的凋亡中发挥重要作用。 4. Pae可明显抑制PDGF-BB诱导的HSC-T6中β-arrestin2表达增加,提示Pae可能改变β-arrestin2的表达,从而抑制HSC-T6增殖、促进HSC-T6凋亡,维持其正常功能。